雌激素受體S309位點(diǎn)基因替代鼠的建立及該位點(diǎn)磷酸化在小鼠乳腺發(fā)育中的作用.pdf

1、研究背景:
　　雌激素及其受體(EstrogenReceptor,ER)信號(hào)系統(tǒng)在乳腺的發(fā)育和功能分化,以及疾病過(guò)程中有著非常重要的作用。乳腺的良惡性病變?nèi)缛橄倌倚栽錾　⑷橄侔┑榷寂cER信號(hào)系統(tǒng)的失調(diào)有關(guān)。自上個(gè)世紀(jì)六十年代ElwoodVJensen首次從理論上證實(shí)雌激素受體的存在以來(lái),對(duì)于ER的研究一直沒(méi)有間斷過(guò)。雌激素受體有五個(gè)結(jié)構(gòu)域,其激活途徑主要有三種,包括經(jīng)典的配體激活途徑、非經(jīng)典激活途徑及磷酸化激活途徑。ER與雌激素

2、結(jié)合后形成配體-受體復(fù)合物,引發(fā)雌激素受體的構(gòu)象改變形成二聚體并向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位,并與靶基因上的作用元件ERE結(jié)合激活其轉(zhuǎn)錄;另外ER還可與AP1、SP1等結(jié)合激活相應(yīng)的靶基因轉(zhuǎn)錄。除了配體結(jié)合激活途徑外,ER還有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)。這些位點(diǎn)大多位于AF1區(qū),例如305位絲氨酸的磷酸化可使ER在未與配體結(jié)合狀態(tài)下激活。但目前對(duì)于雌激素受體磷酸化位點(diǎn)與乳腺的發(fā)育、癌變等關(guān)系研究并不透徹。
　　基因替代鼠(Knockinmice)是研究基因

3、/蛋白特定位點(diǎn)功能的非常有效的途徑和工具,可以建立人類疾病相關(guān)的動(dòng)物模型,在研究探討疾病的發(fā)病機(jī)制、相關(guān)基因分析、疾病預(yù)防等方面起到重要作用;也可以作為新藥研發(fā)的重要評(píng)價(jià)體系。因此,基因替代鼠不僅有利于帶動(dòng)生命科學(xué)的前沿發(fā)展,也在醫(yī)學(xué)研究中起到先導(dǎo)作用。
　　王瑞安等人前期發(fā)現(xiàn)ER的305位絲氨酸(ER-S305)是一磷酸化位點(diǎn)。Pak1激酶和PKA激酶均可磷酸化這一位點(diǎn)。該位點(diǎn)的磷酸化可使ER在不與配體結(jié)合的狀態(tài)下激活,因而可能

4、參與乳腺的癌變并與乳腺癌對(duì)抗雌激素療法的耐藥性有關(guān)。
　　本實(shí)驗(yàn)擬建立與人ER-S305位點(diǎn)同位的ER-S309A基因突變鼠,觀察該磷酸化位點(diǎn)的消失對(duì)乳腺發(fā)育和癌變的影響,闡明ER在體內(nèi)的調(diào)節(jié)機(jī)制,并進(jìn)一步探討該位點(diǎn)做為乳腺癌化學(xué)預(yù)防、治療潛在靶點(diǎn)的可能性提供相關(guān)依據(jù)。
　　目的
　　通過(guò)建立ERS309A基因替代鼠,研究將該位點(diǎn)的絲氨酸突變?yōu)楸彼崾ミ@一磷酸化位點(diǎn)后小鼠的乳腺發(fā)育情況。通過(guò)觀察純合型替代鼠的乳腺發(fā)育

5、情況、動(dòng)情周期的變化,及給予雌激素后乳腺發(fā)育和動(dòng)情周期的改變,分析ER-S309位點(diǎn)的磷酸化及能夠磷酸化這一位點(diǎn)的激酶分子在生殖功能和乳腺發(fā)育中的作用。
　　方法
　　1.建立ER-S309A基因替代鼠。剪尾提取總DNA,PCR擴(kuò)增相應(yīng)基因改變片段經(jīng)基因測(cè)序確定替代鼠的建立是否成功。
　　2.將雜合子小鼠相互交配。用PCR結(jié)合酶切分析鑒定基因型。分析子代小鼠的比例是否符合孟德爾遺傳規(guī)律。并觀察純合型雌性小鼠及雄性小鼠是

6、否具有繁育能力,如能繁育則觀測(cè)雌性小鼠的哺育能力。
　　3.分別測(cè)定純合型與野生型雌性小鼠血中雌二醇的濃度。
　　4.分別取6、9、12周齡的純合型和野生型雌性小鼠的第3、4對(duì)乳腺卡紅整裝染色觀察發(fā)育情況、HE染色觀察動(dòng)情周期的變化。
　　5.野生型小鼠三周齡時(shí)行雙側(cè)卵巢去勢(shì)手術(shù)后,分為給予雌激素組和對(duì)照組;純合型突變小鼠三周齡開始給予雌激素,分別觀察補(bǔ)充激素組和對(duì)照組小鼠第6、9、12周第4對(duì)乳腺卡紅染色觀察發(fā)育情況

7、,HE染色觀察動(dòng)情周期變化。
　　6.純合型和野生型雌性替代鼠,取其雙側(cè)卵巢、輸卵管HE染色,觀察是否有形態(tài)學(xué)改變。
　　結(jié)果
　　1.基因測(cè)序結(jié)果顯示309位的絲氨酸被丙氨酸所替代,表明我們成功建立了ER-S309A基因替代鼠。
　　2.純合型雄性小鼠不具有生育能力。雌性純合型小鼠具有生育能力,但每窩的鼠仔數(shù)量較野生型雌性小鼠的每窩鼠仔數(shù)量有明顯減少,表明生殖力降低。
　　3.純合型雌性小鼠血中雌二醇濃度

8、同野生型雌性小鼠血中雌二醇濃度相比沒(méi)有明顯差異。
　　4.純合型雌性小鼠的乳腺發(fā)育較正常野生型小鼠慢,導(dǎo)管生長(zhǎng)緩慢、分支減少,乳腺腺泡數(shù)目減少,終末蕾的數(shù)量和面積減少;純合型小鼠的動(dòng)情周期紊亂,角化細(xì)胞數(shù)量減少。
　　5.野生型雌性小鼠去勢(shì)后給予雌激素組乳腺可以正常生長(zhǎng),動(dòng)情周期中出現(xiàn)明顯的角化細(xì)胞;未給予雌激素的對(duì)照組乳腺卡紅染色沒(méi)有明顯的導(dǎo)管生成,沒(méi)有動(dòng)情周期出現(xiàn)。純合型雌性小鼠三周開始給予雌激素后導(dǎo)管生長(zhǎng)速度加快、分支

9、多,終末蕾的數(shù)量、面積增多;動(dòng)情周期可見多量角化細(xì)胞。
　　6.純合型雌性小鼠卵巢和輸卵管沒(méi)有明顯的形態(tài)學(xué)改變。
　　結(jié)論
　　1.ERS309A基因替代鼠的建立成功;
　　2.失去ERS309A磷酸化位點(diǎn)后,雌激素受體功能降低,雄性小鼠喪失生殖功能;雌性小鼠生殖能力降低。
　　3.純合替代鼠血中雌二醇含量正常。
　　4.動(dòng)情周期中S309A替代鼠由于ER功能下降,陰道上皮角化細(xì)胞數(shù)量減少,給予雌激素