RAGE和SLP76相互作用介導(dǎo)的下游信號(hào)通路的研究.pdf

1、隨著生活水平的提高、生活方式的改變和人口的老齡化,糖尿病患病率呈現(xiàn)出世界性的上升趨勢(shì),成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后的第三位嚴(yán)重危害大眾健康的慢性非傳染性疾病。糖尿病及其并發(fā)癥在許多國(guó)家已成為致死、致殘的主要因?yàn)橹?有研究發(fā)現(xiàn)由糖尿病慢性血管并發(fā)癥——?jiǎng)用}粥樣硬化導(dǎo)致的死亡率占糖尿病患者總死亡率的80％左右。單核巨噬細(xì)胞參與到糖尿病血管并發(fā)癥動(dòng)脈粥樣硬化的整個(gè)過(guò)程中,其中包括泡沫細(xì)胞和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成,外周血中的單核細(xì)胞粘附于內(nèi)皮

2、細(xì)胞并遷移到內(nèi)皮下間隙,攝取脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化形成的重要早期事件。同時(shí),大量研究表明晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)在脈管系統(tǒng)的大量積聚在糖尿病血管并發(fā)癥中發(fā)揮著重要作用。血液和組織中的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子長(zhǎng)期暴露在高糖基質(zhì)環(huán)境中發(fā)生了非酶性變的麥拉德反應(yīng)(Maillardreaction),最終導(dǎo)致AGEs的不可逆性形成。AGEs主要通過(guò)與血管細(xì)胞膜表面的

3、AGEs受體——晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation endproducts.RAGE)結(jié)合后,激活細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,進(jìn)而發(fā)揮其病理功能。
　　 RAGE是細(xì)胞膜表面免疫球蛋白超家族跨膜受體的成員之一,能夠與多種配體結(jié)合,其配體除AGEs和β樣片層蛋白外,還包括S100蛋白家族的一些成員(如S100B、S100P、S100A4、S100A6、S100A8/9、S100A11

4、-13)、高遷移率族蛋白1(high mobility group box protein1,HMGB1)和朊病毒蛋白分子。RAGE與配體的結(jié)合能夠引起細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)功能的關(guān)鍵性改變,其中包括細(xì)胞增殖、遷移和炎性介質(zhì)的產(chǎn)生,介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)急損傷和應(yīng)答反應(yīng),從而參與包括糖尿病慢性并發(fā)癥、腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎和神經(jīng)退行性病變等一系列疾病的病理過(guò)程。盡管目前對(duì)于AGEs與RAGE結(jié)合引起多條信號(hào)通路的報(bào)道很多,但是直接關(guān)于RAGE受體下游

5、近端信號(hào)事件的研究卻很少。RAGE短小的胞內(nèi)段在這些依賴RAGE的信號(hào)通路中起到了關(guān)鍵性的作用,但是目前對(duì)于胞內(nèi)段所參與或激活的胞漿內(nèi)信號(hào)通路的具體分子機(jī)制還沒(méi)有報(bào)道。我們實(shí)驗(yàn)室在前期工作中運(yùn)用T7噬菌體展示技術(shù)從人肺cDNA文庫(kù)中篩選到與RAGE胞內(nèi)段相互作用的12種蛋白,含有SH2結(jié)構(gòu)域的76 kDa的白細(xì)胞蛋白(SH2domain-containing leukocyte protein of76kDa,SLP76)就是其中之一。

6、
　　 SLP76是血源性細(xì)胞所特有的一種接頭蛋白,含有533個(gè)氨基酸,包括三個(gè)結(jié)構(gòu)域:即含SAM結(jié)構(gòu)域和三個(gè)酪氨酸磷酸化基序的酸性氨基末端、中間的富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域和羧基末端的SH2結(jié)構(gòu)域。SLP76主要表達(dá)在造血系統(tǒng)和血小板、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞及未成熟B細(xì)胞中,其在T細(xì)胞受體相關(guān)的信號(hào)通路及血小板凝血功能方面起到了重要作用。在細(xì)胞內(nèi)SLP76可以和多種蛋白相互作用,包括能磷酸化SLP76的SYK家族激

7、酶中的70 kDa的T細(xì)胞受體Zeta鏈相關(guān)蛋白激酶(the SYK-family kinaseζ-chain-associated protein kinase of70 kDa,ZAP70)、激活T細(xì)胞的跨膜接頭蛋白(the adaptor proteins of linker for activation of T cells,LAT)、磷脂酶Cγ1(phospholipase Cγ1,PLCγ1)、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子VAV和生

8、長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2(Grb2-related adaptor downstream of Shc,Grb2)等一些蛋白分子,它們共同組成接頭蛋白復(fù)合體參與到多條信號(hào)通路中。
　　 基于上述認(rèn)識(shí),我們提出以下假設(shè):當(dāng)AGEs和RAGE結(jié)合后,RAGE胞內(nèi)段通過(guò)與由SLP76參與構(gòu)成的接頭蛋白復(fù)合體相互作用,再由復(fù)合體中的Grb2將信號(hào)傳遞給Ras,Ras可以激活下游的絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶Raf,信號(hào)由高度保守的三級(jí)激酶模式

9、向下游傳遞,進(jìn)而觸動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激并導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor-κ-gene binding,NF—κB)的活化,使得效應(yīng)細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)量發(fā)生變化,產(chǎn)生相應(yīng)的病理學(xué)效應(yīng)。如果上述假設(shè)能夠得到證實(shí),對(duì)闡明RAGE和SLP76相互作用在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的作用具有重要意義,并且能夠以RAGE和SLP76相互作用為切入點(diǎn)揭示糖尿病血管并發(fā)癥動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制,為其尋找臨床治療方案提供依據(jù)。前期的體內(nèi)、體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)均已

10、證實(shí)RAGE與SLP76兩者之間存在相互作用,同時(shí)證實(shí)這種相互作用具有刺激依賴性。通過(guò)對(duì)SLP76各結(jié)構(gòu)域及磷酸化位點(diǎn)的功能性研究發(fā)現(xiàn),在RAGE和SLP76過(guò)表達(dá)的HEK293細(xì)胞模型中,SLP76的第145位、第173位酪氨酸以及第207位絲氨酸位點(diǎn)的突變和SAM結(jié)構(gòu)域缺失突變對(duì)RAGE-SLP76相互作用有影響。
　　 基于實(shí)驗(yàn)室前期工作和以上認(rèn)識(shí),本研究對(duì)RAGE和SLP76相互作用介導(dǎo)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活情況進(jìn)行了

11、初步研究。研究包括以下兩個(gè)部分:
　　 第一部分:RAGE和SLP76相互作用介導(dǎo)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究
　　 1.首先,為明確RAGE和SLP76是否參與到MAPK信號(hào)通路的活化過(guò)程,我們將外源性的質(zhì)粒pcDNA3-HA-RAGE和pcDNA3-Flag-SLP76共轉(zhuǎn)染到RAGE和SLP76表達(dá)缺陷的HEK293細(xì)胞,并設(shè)立轉(zhuǎn)染空載體組和單轉(zhuǎn)染組作為對(duì)照,選取實(shí)驗(yàn)室前期工作中證明的RAGE和SLP76相互作用活化M

12、APK最強(qiáng)的時(shí)間點(diǎn)10 min作為AGEs的刺激時(shí)間,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)通路的激活情況,這為確定RAGE和SLP76是否參與到MAPK信號(hào)通路的活化過(guò)程中提供了依據(jù),結(jié)果發(fā)現(xiàn),RAGE和SLP76均參與到ERK的活化過(guò)程中。
　　 2.既然SLP76參與了ERK的活化過(guò)程,前期工作通過(guò)對(duì)SLP76各結(jié)構(gòu)域及磷酸化位點(diǎn)的功能性研究發(fā)現(xiàn):SLP76的第145位、第173位酪氨酸以及第207位絲氨酸位點(diǎn)的突變和SAM結(jié)構(gòu)域缺失突變

13、對(duì)RAGE-SLP76相互作用有影響。那么SLP76第145位酪氨酸、第173位酪氨酸及第207位絲氨酸位點(diǎn)的突變和SAM結(jié)構(gòu)域缺失對(duì)ERK的活化又會(huì)產(chǎn)生什么影響呢?我們將pcDNA3-HA—RAGE和SLP76的四種突變體共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,并設(shè)立轉(zhuǎn)染空載體組、單轉(zhuǎn)染組和pcDNA3-HA-RAGE和pcDNA3-Flag-SLP76共轉(zhuǎn)染組作為對(duì)照,然后給予AGEs刺激10 min,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)通路的激活情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)

14、SLP76第145位酪氨酸、第173位酪氨酸及第207位絲氨酸位點(diǎn)的突變對(duì)ERK的活化有影響,而SAM結(jié)構(gòu)域缺失突變對(duì)ERK的活化無(wú)影響。
　　 3.RAGE和SLP76在單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)皆有表達(dá),這是兩者發(fā)生相互作用并介導(dǎo)信號(hào)通路激活的物質(zhì)基礎(chǔ)和客觀條件,而單核巨噬細(xì)胞又是炎癥反應(yīng)的重要參與者,因此為了進(jìn)一步明確細(xì)胞中內(nèi)源性的RAGE和SLP76相互作用的生物學(xué)效應(yīng),接下來(lái)我們用AGEs刺激RAW264.7細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MA

15、PKs家族信號(hào)通路的激活情況。首先采用免疫印跡western blot研究RAGE和SLP76相互作用介導(dǎo)的下游MAPK信號(hào)通路激活的時(shí)間效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)立AGEs刺激RAW264.7細(xì)胞0 min、1 min、2 min、5 min、10 min、15 min、30 min和60 min組,western blot檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)通路的激活情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ERK和p38均能被激活,且具有不同的時(shí)間效應(yīng),而JNK在刺激前后激活現(xiàn)象不明

16、顯。既然ERK和p38均能被激活,為了進(jìn)一步探討其下游信號(hào)通路的激活情況,設(shè)立了AGEs刺激RAW264.7細(xì)胞0 min、10 min、60 min、90 min、120 min和240min組,再采用western blot分析NF-κB通路的激活情況,結(jié)果顯示IKKα/β在AGEs刺激10 min就開(kāi)始激活,一直持續(xù)到4 h。為分析調(diào)控AGEs所激活MAPK通路中的上游激酶,接下來(lái)我們用ERK1/2激酶抑制劑PD98059預(yù)處理細(xì)

17、胞,然后再給予AGEs刺激,western blot檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)通路受抑制情況,結(jié)果顯示40μM的PD98059能完全抑制ERK的磷酸化激活；最后利用LiquiChip-液相芯片技術(shù)檢測(cè)AGEs刺激下細(xì)胞因子表達(dá)譜的變化情況,從而初步探討了RAGE和SLP76相互作用介導(dǎo)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活情況,為深入研究這種信號(hào)通路的激活在糖尿病慢性并發(fā)癥等炎癥性疾病中的作用奠定了理論基礎(chǔ)。
　　 4.由以上結(jié)果可知,在pcD

18、NA3-HA-RAGE和pcDNA3-Flag-SLP76共轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞模型中,結(jié)果表明RAGE和SLP76均參與到ERK的活化過(guò)程中。同時(shí),AGEs刺激能引起RAW264.7細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)通路中的ERK和p38的磷酸化現(xiàn)象增強(qiáng),這種磷酸化增強(qiáng)現(xiàn)象是否是由RAGE和SLP76相互作用介導(dǎo)的呢?為進(jìn)一步證實(shí)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)源性RAGE和SLP76存在相互作用并參與MAPK信號(hào)通路的活化,我們用AGEs刺激RAW264.

19、7細(xì)胞1 min,2 min,5 min,10 min,15 min,30 min,60 min七個(gè)時(shí)間點(diǎn),并設(shè)立不刺激組(0 min組)作為對(duì)照,裂解細(xì)胞收集細(xì)胞裂解液上清。用抗RAGE的抗體耦合蛋白G親和瓊脂糖珠進(jìn)行免疫共沉淀,將沉淀下來(lái)的復(fù)合物經(jīng)SDS-PAGE電泳分離,然后分別采用抗RAGE抗體和抗SLP76抗體進(jìn)行western blot檢測(cè),分析RAGE和SLP76之間的相互作用。
　　 第二部分:沉默RAGE基因表

20、達(dá)的RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定
　　 RAGE是免疫球蛋白超家族跨膜受體的成員之一,其在結(jié)構(gòu)上由三部分組成,即胞外段、跨膜段和只含有43個(gè)氨基酸的短小胞內(nèi)段,其中胞外段又包含三個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域,即一個(gè)V型結(jié)構(gòu)域緊接兩個(gè)C型結(jié)構(gòu)域。通過(guò)對(duì)RAGE結(jié)構(gòu)功能的研究表明V型結(jié)構(gòu)域在結(jié)合配體方面起到重要作用,而短小的胞內(nèi)段在RAGE介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路方面起到了關(guān)鍵性的作用,但是目前對(duì)于胞內(nèi)段所參與或激活的胞漿內(nèi)信號(hào)通路的具體分子

21、機(jī)制報(bào)道很少。我們希望借助慢病毒RNA干擾技術(shù),阻斷RAGE和SLP76的相互作用,這對(duì)于闡明兩者之間的相互作用介導(dǎo)的信號(hào)通路具有重要意義。
　　 RNA干擾(RNA interference,RNAi)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種重要的基因沉默技術(shù),通過(guò)轉(zhuǎn)錄后的基因沉默方式(post-transcriptional gene silencing,PTGs)來(lái)沉默相應(yīng)基因的表達(dá),由21-23個(gè)堿基組成的小干擾RNA(small inter

22、ference,siRNA)是關(guān)鍵性的作用分子,它可以特異性地與靶基因的mRNA結(jié)合導(dǎo)致相應(yīng)的mRNA降解,最終導(dǎo)致靶基因表達(dá)水平的降低,因此RNAi在研究基因的功能及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面具有良好的應(yīng)用前景。目前,用于沉默基因表達(dá)的RNA干擾技術(shù)主要有化學(xué)合成的siRNA、表達(dá)短發(fā)夾樣RNA(short hairpin,shRNA)的質(zhì)粒載體和表達(dá)shRNA的病毒載體,質(zhì)粒載體和病毒載體可以在宿主細(xì)胞內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄出shRNA,而shRN

23、A可以被內(nèi)源性的Dicer酶切割成siRNA雙鏈發(fā)揮RNAi作用。因此,與siRNA相比,質(zhì)粒載體和病毒載體可以長(zhǎng)時(shí)間、穩(wěn)定的誘導(dǎo)基因沉默,在研究基因功能及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面具有更大的優(yōu)勢(shì)。慢病毒是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒(human immunodeficiency virus1,HIV-1)為基礎(chǔ)發(fā)展形成的一種病毒載體,對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞都具有很強(qiáng)的感染能力,并且慢病毒載體具有低免疫原性及基因整合率高等優(yōu)點(diǎn),被廣泛用于RNAi和基因

24、表達(dá)的載體。
　　 我們利用Invitrogen在線軟件設(shè)計(jì)了三條RAGE基因shRNA序列,合成、退火形成雙鏈寡核苷酸(double strand oligo,dS oligo)后克隆到線性的pENTRTM/H1/TO載體的黏性末端,測(cè)序。得到的陽(yáng)性重組子再與慢病毒載體進(jìn)行重組反應(yīng),從而獲得RAGE基因的真核表達(dá)慢病毒干擾載體。在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下將慢病毒包裝輔助復(fù)合體和RAGE基因的真核表達(dá)慢病毒載體導(dǎo)入293FT細(xì)胞包裝病毒,

25、測(cè)定病毒滴度,感染PC-3細(xì)胞,檢驗(yàn)其干擾RAGE基因表達(dá)的有效性。
　　 通過(guò)以上研究,我們得出以下幾點(diǎn)結(jié)論:
　　 1.RAGE和SLP76均參與了ERK的磷酸化激活,RAGE和SLP76的相互作用介導(dǎo)了ERK的活化過(guò)程。
　　 2.SLP76第145位酪氨酸、第173位酪氨酸及第207位絲氨酸位點(diǎn)的突變對(duì)ERK的活化有影響,而SAM結(jié)構(gòu)域缺失突變對(duì)ERK的活化無(wú)影響。
　　 3.內(nèi)源性的RAGE和S

26、LP76存在相互作用。在AGEs刺激下,能激活RAW264.7細(xì)胞內(nèi)的ERK和p38通路,而JNK在刺激前后不受影響。并且ERK和p38的激活具有不同的時(shí)間效應(yīng)。ERK在不刺激時(shí)有微弱磷酸化現(xiàn)象,AGEs刺激5 min時(shí)磷酸化開(kāi)始明顯增強(qiáng),10 min時(shí)磷酸化程度達(dá)高峰,此后一直持續(xù)在磷酸化高水平狀態(tài),60 min時(shí)磷酸化現(xiàn)象開(kāi)始衰減。而對(duì)于p38,在不刺激時(shí)也有微弱的磷酸化現(xiàn)象,AGEs刺激1 min時(shí)磷酸化現(xiàn)象就明顯激活,此后一直持

27、續(xù)在磷酸化高水平狀態(tài),30 min時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)衰減。
　　 4.AGEs刺激RAW264.7細(xì)胞,亦能激活MAPK下游的NF-κB信號(hào)通路,其激活也具有一定的時(shí)間效應(yīng),10 min即到達(dá)高峰,這種激活狀態(tài)一直持續(xù)到6h；且AGEs刺激可引起RAW264.7細(xì)胞因子巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α(MacrophageInflammatory Protein-1 alpha,MIP-1α)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosisfac

28、tor-alpha,TNF-α)表達(dá)量的變化。
　　 5.ERK1/2激酶抑制劑PD98059能抑制AGEs刺激引起的ERK和NF-κB的激活。
　　 6.成功構(gòu)建了沉默RAGE基因表達(dá)的慢病毒入門(mén)載體和表達(dá)載體,并成功包裝出高滴度的慢病毒,其滴度達(dá)8.7×106 U/ml。并檢測(cè)了慢病毒能成功沉默PC-3細(xì)胞中RAGE基因的表達(dá),為進(jìn)一步探討在RAGE和SLP76相互作用所激活的信號(hào)通路中,RAGE的功能性研究奠定了基