GATA2與Smad4相互作用對(duì)TGFβ信號(hào)通路負(fù)調(diào)控的初步研究.pdf

1、GATA2屬于鋅指類轉(zhuǎn)錄因子GATA家族成員之一。該蛋白廣泛表達(dá)于造血干細(xì)胞(HSCs),參與調(diào)控HSCs增殖、分化與自我更新等生理功能。TGFβ信號(hào)通路是參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖及腫瘤生成等多種生理病理學(xué)過程的重要信號(hào)通路,同時(shí)參與了HSCs的自我更新過程。Smad4是TGFβ通路中重要的節(jié)點(diǎn)分子,能夠與其他Smads家族成員結(jié)合,介導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)傳遞至細(xì)胞核,并且調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)室前期利用大規(guī)模酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)GATA2與

2、Smad4具有高度可信相互作用,進(jìn)一步研究驗(yàn)證了GATA2與Smad4相互作用確實(shí)存在,并且共定位于細(xì)胞核,但GATA2與Smad4相互作用的意義以及機(jī)制并不明確。因此本研究利用外源性免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了GATA2與Samd4存在相互作用。利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),證明了GATA2能夠抑制Smad4及其家族成員中R-Smads的轉(zhuǎn)錄活性;K562細(xì)胞中過表達(dá)GATA2,能夠抑制內(nèi)源性Smad4的轉(zhuǎn)錄活性;同時(shí)GATA2能夠抑制TGFβ通

3、路下游靶基因PAI-1的表達(dá)。上述實(shí)驗(yàn)表明,GATA2通過抑制Smad4的轉(zhuǎn)錄活性,從而抑制TGFβ通路。利用實(shí)驗(yàn)室前期根據(jù)GATA2結(jié)構(gòu)域所構(gòu)建的不同缺失體進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè),證明 GATA2對(duì)Smad4的抑制作用是通過其結(jié)構(gòu)域中的N端及其鋅指結(jié)構(gòu)。本研究驗(yàn)證了TGFβ因子刺激能夠抑制Huh7細(xì)胞的增殖。通過構(gòu)建GATA2慢病毒表達(dá)載體,包裝慢病毒并建立GATA2過表達(dá)的Huh7穩(wěn)定細(xì)胞系,證明GATA2能夠抑制Huh7細(xì)胞對(duì)T

4、GFβ刺激的敏感性。為進(jìn)一步在HSCs細(xì)胞中檢測(cè)GATA2功能及作用機(jī)制,構(gòu)建了人GATA2的慢病毒RNAi干涉載體,并對(duì)慢病毒進(jìn)行了包裝,獲得了GATA2 RNAi慢病毒顆粒,建立了K562,TF-1的siGATA2穩(wěn)定細(xì)胞系,為后續(xù)的研究打下良好的基礎(chǔ)。GATA2通過與Smad4發(fā)生相互相互作用,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制活性,從而負(fù)調(diào)控TGFβ信號(hào)通路,并且抑制下游靶基因的表達(dá)。GATA2對(duì)TGFβ信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控作用可能在造血干細(xì)胞的自我更新