S型氯代甘油醇對精子獲能相關(guān)蛋白磷酸化的影響及機(jī)制研究.pdf

1、氯代甘油醇(α-chlorohydrin，ACH)，化學(xué)名3-氯-1，2-丙二醇(3-mono-chloro-propane-1，2-diol，3-MCPD)，是一種重要化工原料，普通人群可通過食用受污染的食物及以表氯醇樹脂過濾的飲用水暴露ACH。ACH有R型(R)-α-chlorohydrin，RACH)和S型((S)-α-chlorohydrin，SACH)兩種異構(gòu)體。S型氯代甘油醇(SACH)被認(rèn)為是經(jīng)典的睪丸后毒物，短期低劑量經(jīng)

2、口染毒SACH可致多種雄性動物可逆性的不育。為研究SACH影響精子受精過程中可能的作用機(jī)制，本研究圍繞SACH與大、小鼠/人精子獲能相關(guān)蛋白磷酸化關(guān)系，深入分析SACH對精子獲能調(diào)控信號通路的影響。
　　 第一部分 S型氯代甘油醇對大鼠精子功能的影響
　　 本研究以改良的Biggers，Whitten，Whittingham培養(yǎng)液(BWW)，37℃，5％CO2為大鼠精子獲能孵育條件，觀察6 h獲能過程中自發(fā)性頂體反應(yīng)和蛋

3、白酪氨酸磷酸化變化及體外精卵融合狀況，以驗證該孵育條件是否支持大鼠精子獲能。結(jié)果顯示，大鼠附睪尾精子在獲能孵育之初幾乎不發(fā)生頂體反應(yīng)，蛋白酪氨酸磷酸化也處于低水平。隨著孵育時間延長，精子自發(fā)性頂體反應(yīng)率逐漸增加，在獲能孵育6 h頂體反應(yīng)發(fā)生率接近60％；精子的蛋白酪氨酸磷酸化水平在4.5 h之后開始增強(qiáng)，在6 h磷酸化較為充分。在該孵育條件下，大鼠精卵融合率平均達(dá)到59.1％。以上結(jié)果表明，該孵育條件可充分支持大鼠精子獲能。
　　

4、 為觀察SACH對大鼠精子功能影響，本研究在獲能條件下以10μM、25μM、50μM和100μM SACH染毒大鼠附睪尾精子6 h，結(jié)果顯示：25μM SACH就可抑制精子運動速率，包括VAP，VCL和VSL以及精子頭擺動幅度；精子超活化也受到抑制，25μM、50μM和100μM劑量組精子VCL≥400μm/s的比例與對照相比均大幅下降(P<0.05)；自發(fā)性頂體反應(yīng)可被10μM和25μM SACH明顯抑制，而濃度繼續(xù)增加(≥50μM

5、)則與對照沒有顯著差別。SACH抑制大鼠精子蛋白酪氨酸磷酸化的作用非常顯著，100μM SACH可使85 kDa條帶蛋白酪氨酸磷酸化水平下降近90％，52 kDa條帶下降70％。但100μM SACH對大鼠精卵融合無顯著影響，1.0 mM或10 mM SACH才可顯著降低二細(xì)胞發(fā)生率。故SACH可顯著抑制SD大鼠精子的運動速率、超活化以及蛋白酪氨酸磷酸化。
　　 第二部分 S型氯代甘油醇對大鼠精子獲能相關(guān)蛋白磷酸化的影響

6、　　 以cAMP/蛋白激酶A(PKA)介導(dǎo)的蛋白酪氨酸磷酸化是動物精子獲能調(diào)控的關(guān)鍵信號途徑。PKA通過磷酸化目標(biāo)蛋白絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)殘基間接調(diào)控下游蛋白酪氨酸磷酸化。本研究結(jié)果顯示，大鼠附睪尾精子在獲能過程出現(xiàn)PKA底物磷酸化逐漸增強(qiáng)；在獲能末期，磷脂酰肌醇－3激酶(P13K)85 kDa/55 kDa亞基均被酪氨酸磷酸化。以SACH在獲能條件下染毒大鼠精子，結(jié)果顯示PKA底物磷酸化和P13K85 kDa/55 kD

7、a酪氨酸磷酸化可被50μM和100μM SACH顯著抑制，提示PKA和PI3K活性可能受抑制。PKA活性受cAMP調(diào)控，本研究發(fā)現(xiàn)50μM和100μM SACH可減低大鼠精子cAMP水平，而加入cAMP類似物dbcAMP和磷酸二酯酶抑制劑IBMX可拮抗SACH對獲能相關(guān)蛋白磷酸化的抑制作用，提示SACH通過抑制cAMP而影響下游獲能相關(guān)磷酸化。SACH可抑制大鼠精子特異的3－磷酸甘油脫氫酶(GAPDS)活性，降低其ATP水平，而加入甘油

8、可保護(hù)精子GAPDS、ATP、蛋白酪氨酸磷酸化、PKA底物磷酸化和PI3K酪氨酸磷酸化不受SACH抑制，表明糖酵解抑制是SACH影響精子蛋白磷酸化的原因。然而，研究未發(fā)現(xiàn)大鼠精子蛋白酪氨酸磷酸化被SACH抑制與其功能受損存在直接聯(lián)系。
　　 第三部分 S型氯代甘油醇對人和小鼠精子獲能相關(guān)蛋白酪氨酸磷酸化的影響
　　 為了解其他動物精子在獲能過程中蛋白磷酸化變化規(guī)律，本研究將人和小鼠精子在相應(yīng)獲能獲能下孵育5h或2h，結(jié)果

9、發(fā)現(xiàn)，人和小鼠精子在獲能孵育條件下發(fā)生蛋白酪氨酸磷酸化，人精子的110 kDa和85 kDa條帶磷酸化最為顯著，而小鼠在83 kDa條帶最為顯著，且均可被SACH抑制。本研究證實，甘油可以保護(hù)人精子蛋白酪氨酸磷酸化不受SACH抑制，且人精子更傾向于利用糖酵解途徑產(chǎn)生的ATP磷酸化相關(guān)蛋白，據(jù)此推測，SACH可能通過與在大鼠相似途徑抑制人精子蛋白磷酸化。與大鼠不同，在本研究中，小鼠精子PKA底物磷酸化在獲能過程逐漸下降，但仍可被SACH抑

10、制。SACH可抑制小鼠GAPDS活性，同時可影響小鼠精子與卵子黏附能力。為探討精子體外獲能受精過程的生理生化改變是否能作為評價雄性生殖毒物的方法，本研究以3－溴丙酮酸(BrPA)和奧硝唑，氟化物和新型污染物碘乙酸(IAA)等糖酵解抑制劑在獲能條件下染毒人精子，結(jié)果表明這些化學(xué)物對人精子蛋白酪氨酸磷酸化有不同程度的抑制。提示某些環(huán)境化學(xué)物可影響精子功能的作用，外源化學(xué)物對體外精子的蛋白酪氨酸磷酸化影響有望作為雄性生殖毒物篩選測試的體外評價