α-突觸核蛋白在BV2小膠質(zhì)細(xì)胞鐵代謝中的作用及其分子機(jī)制.pdf

1、帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病。主要癥狀是肌肉僵直，靜止性震顫和姿勢(shì)反射障礙，它是繼阿爾茨海默病之后的第二大神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。PD的主要病理學(xué)特征是黑質(zhì)致密帶（substantia nigra pars compactor，SNpc）多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元的損傷，殘存的神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)以α-突觸核蛋白（α-synuclein，α-syn）為主要成分的酸性包涵體（lewy

2、 body，LBs）。雖然遺傳，環(huán)境和氧化應(yīng)激發(fā)揮一定的作用，但PD的確切發(fā)病機(jī)制尚未完全了解。
　　在PD的發(fā)病過(guò)程當(dāng)中，鐵起到了關(guān)鍵的作用，鐵的過(guò)度沉積可能參與了PD DA能神經(jīng)元的變性死亡過(guò)程。研究顯示鐵轉(zhuǎn)入蛋白二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（divalent metal-ion transporter-1，DMT1）在PD病人和PD模型的黑質(zhì)（substantia nigra，SN）內(nèi)高表達(dá)，表明DMT1的代謝紊亂可能導(dǎo)致了該區(qū)鐵的

3、選擇性聚積，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡。Ferroportin1（FPN1）是目前所知唯一一種跨膜的鐵轉(zhuǎn)出蛋白，F(xiàn)PN1的功能缺失會(huì)引起鐵代謝的紊亂。鐵調(diào)節(jié)蛋白(iron regulatory proteins，IRPs)是鐵代謝相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的最重要的因素，可與DMT1 mRNA的3’端鐵應(yīng)答元件（iron response element，IRE）和FPN1 mRNA5’端的IRE結(jié)合，調(diào)控鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)。最近許多研究表明缺氧誘

4、導(dǎo)因子（hypoxia‐inducible factors，HIFs）是鐵穩(wěn)態(tài)的重要決定因素。除了缺氧，許多其他刺激可以激活HIFs，HIFs與缺氧反應(yīng)元件（hypoxic response elements，HRE）結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，調(diào)控鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)。
　　α-Syn是一個(gè)140氨基酸殘基的細(xì)胞溶質(zhì)性神經(jīng)元蛋白，主要合成于突觸終端，據(jù)報(bào)道α-Syn主要與突觸小泡運(yùn)輸，突觸囊泡池的調(diào)控有關(guān)。α-syn作為L(zhǎng)Bs的主要成

5、分，在SN中聚集形成不溶性聚集體并引起神經(jīng)毒性。神經(jīng)病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)SN內(nèi)α-syn的異常聚集常常伴有鐵沉積，近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，α-syn是鐵還原酶，能將Fe3+還原成Fe2+。α-syn本身作為一種鐵代謝相關(guān)的蛋白，其表達(dá)異常必然參與了細(xì)胞鐵代謝。但是，鐵和α-syn相互聯(lián)系的具體分子機(jī)制仍然不清楚。
　　PD SN神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞有鐵的沉積。小膠質(zhì)細(xì)胞不能合成α-syn但可以吞噬α-syn，那么吞噬的α-syn對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞鐵代謝有

6、什么影響?本研究應(yīng)用外源性α-syn處理小膠質(zhì)細(xì)胞，觀察了α-syn單體（monomericα-synuclein，M-α-syn）和α-syn寡聚體(oligomericα-synuclein，O-α-syn)的鐵還原酶活性以及α-syn對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞鐵代謝的影響。
　　結(jié)果如下：
　　1.0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L、5μmol/L、6μmol/L、7μmol/L、8μ

7、mol/L M-α-syn處理 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L、5μmol/L組活性與對(duì)照組相比細(xì)胞的存活率沒(méi)有明顯變化（P＞0.05, n=6）。因此選定1μmol/L，3μmol/L，5μmol/L為后面實(shí)驗(yàn)中所應(yīng)用濃度。
　　2.0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L、5μmol/L、6μmol/

8、L、7μmol/L、8μmol/L O-α-syn處理 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L、5μmol/L組活性與對(duì)照組相比細(xì)胞的存活率沒(méi)有明顯變化（P＞0.05, n=6）。因此選定1μmol/L，3μmol/L，5μmol/L為后面實(shí)驗(yàn)中所應(yīng)用濃度。
　　3.1μmol/L，3μmol/L，5μmol/L的M-α-syn處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞系24

9、小時(shí)，DMT1表達(dá)量明顯上調(diào)，5μmol/L表達(dá)量是對(duì)照組的1倍（P＜0.001, compared with control group. n=6），而FPN1表達(dá)量并未發(fā)生明顯改變（P＞0.05, n=6）。
　　4.1μmol/L，3μmol/L，5μmol/L的M-α-syn處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞系24小時(shí)，IRP1和HIF-2α表達(dá)量并未發(fā)生明顯改變（P＞0.05, n=6）。
　　5.1μmol/L，3μmol/L

10、，5μmol/L的O-α-syn處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞系24小時(shí)，DMT1和FPN1表達(dá)量明顯上調(diào)，DMT1和FPN1表達(dá)量在3μmol/L時(shí)最高，是對(duì)照組的1倍（P＜0.001,n=6）。
　　6.1μmol/L，3μmol/L，5μmol/L的O-α-syn處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞系24小時(shí)，IRP1和HIF-2α表達(dá)量并未發(fā)生明顯改變（P＞0.05, n=6）。
　　7.1μmol/L M-α-syn及O-α-syn處理BV

11、2小膠質(zhì)細(xì)胞24h，可以增加細(xì)胞對(duì)Fe2+的攝取，與對(duì)照組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，n=6)。
　　8.1μmol/L M-α-syn處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞24h，細(xì)胞對(duì)Fe2+的轉(zhuǎn)出，與對(duì)照組相比并無(wú)明顯變化，差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05, n=6）,1μmol/L O-α-syn處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞24h，細(xì)胞對(duì)Fe2+的轉(zhuǎn)出明顯增強(qiáng)，與對(duì)照組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（(P＜0.01，n=6）
　　9.100μm

12、ol/L M-α-syn及O-α-syn處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞4h，加入Ferrozine溶液（100μmol/L）、NADH溶液（100μmol/L）、MOPS溶液（100mmol/L）、Cuso4溶液（300μmol/L）、FAC溶液（100μmol/L），酶標(biāo)儀562nm處檢測(cè)M-α-syn以及O-α-syn鐵還原酶活性升高，與對(duì)照組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，n=6)，O-α-syn鐵還原酶活性高于M-α-syn活性，差別

13、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，n=6)。
　　上述結(jié)果表明：M-α-syn及O-α-syn均有鐵還原酶活性，且O-α-syn活性強(qiáng)于M-α-syn。α-syn參與了BV2小膠質(zhì)細(xì)胞鐵的代謝，M-α-syn和O-α-syn引起DMT1表達(dá)的增加，鐵轉(zhuǎn)入增多。O-α-syn引起FPN1表達(dá)的增加，鐵轉(zhuǎn)出增強(qiáng)。α-syn對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞鐵的代謝的影響與IRP1和HIF-2α的調(diào)節(jié)無(wú)關(guān)，而與α-syn鐵還原酶活性有關(guān)。本研究為α-syn參