鐵誘導alpha-突觸核蛋白聚集的機制研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一種常見的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，以肌強直、肢體震顫和運動減少等癥狀為主要臨床表現(xiàn)。其主要病理特征為黑質(substantia nigra，SN)多巴胺(dopamine，DA)能神經元的缺失和細胞內路易小體(Lewy bodies，LBs)的形成。我國65歲以上的人群PD的患病率為1.7％，隨著我國社會經濟的發(fā)展和老齡化社會的加劇，PD的發(fā)病率勢必進一步攀升。但是由于該病的確切

2、病因和發(fā)病機制尚不清楚，使之無法從根本上預防和治療PD并延緩其進展，因此，深入探討PD的發(fā)病機制無疑對推動PD的防治具有重要的科學意義。
　　 鐵在PD的發(fā)病過程中起著關鍵的作用，過量的游離鐵，特別是Fe2+可以通過Fenton反應形成羥自由基(hydroxyl radical，OH.)，而Fe3+則可以通過Haber-Weiss循環(huán)還原成Fe2+進而生成OH·。OH·通過損傷蛋白質、核酸、和含有大量未飽和脂肪酸的細胞膜，最終導

3、致細胞死亡。目前已有大量證據(jù)表明alpha-突觸核蛋白在PD的發(fā)病機制中起到重要的作用。Alpha-突觸核蛋白的過量表達可以導致其聚集體的形成并對細胞產生毒性。神經病理學研究發(fā)現(xiàn)以alpha-突觸核蛋白異常聚集為主要病理變化的多種突觸蛋白病往往伴有鐵的堆積，說明鐵與alpha-突觸核蛋白聚集之間存在一定聯(lián)系。另有實驗證實Fe2+和Fe3+可在體外及細胞內促進alpha-突觸核蛋白的聚集。最近，人們在alpha-突觸核蛋白的5’端未翻譯區(qū)

4、(untranslated region，UTR)發(fā)現(xiàn)了類鐵反應元件(iron responsive element，IRE)，這一發(fā)現(xiàn)為鐵可能通過增加alpha-突觸核蛋白的表達導致DA能神經元的死亡提供了依據(jù)。為了探討鐵誘導alpha-突觸核蛋白聚集的機制，本實驗應用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法，流式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM），硫磺素S和熒光雙標記，逆轉錄多

5、聚酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)及免疫印跡等多種實驗方法，在SK-N-SH神經母細胞瘤細胞中觀察抗氧化劑維生素E(vitamin E，VE)對鐵誘導的細胞損傷和alpha-突觸核蛋白聚集情況的變化，探討鐵誘導的氧化應激與alpha-突觸核蛋白聚集之間的關系:構建含有alpha-突觸核蛋白mRNA5’-UTR類IRE的質粒alpha-synuclei

6、n-IRE-Luc，應用雙熒光素酶檢測(dual luciferase reporter assay)的方法在HEK293細胞中探討其是否是功能性的鐵反應元件，并在SK-N-SH細胞中證實鐵可以通過鐵調節(jié)蛋白(iron regulatory proteins，IRPs)-IRE系統(tǒng)調節(jié)alpha-突觸核蛋白的表達。結果如下：
　　 1、1 mmol/L Fe2+和Fe3+處理SK-N-SH細胞24h，細胞存活率下降，細胞內活性氧

7、物質（reactive oxygen species，ROS）生成增加，與對照組相比差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；細胞內alpha-突觸核蛋白的聚集較對照組明顯增多；
　　 2、5 umol/L VE與1 mmol/L Fe2+或1 mmol/L Fe3+共孵育SK-N-SH細胞24h可以完全抑制鐵誘導的ROS生成和細胞存活率的下降；5 umol/L VE能部分但不能完全阻斷細胞內alpha-突觸核蛋白聚集，提示氧化應激部分

8、參與了鐵誘導的alpha-突觸核蛋白聚集；
　　 3、成功構建了攜帶alpha-突觸核蛋白mRNA5’-UTR類IRE的alpha-synuclein-IRE-Luc熒光素酶報告載體，應用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)在HEK293細胞中檢測插入的類IRE在轉錄后水平上的調節(jié)：同時構建了攜帶Ferroportinl mRNA5'-UTR IRE的Ferroportinl-IRE-Luc熒光素酶報告載體作為陽性對照；
　　 4、1 m

9、mol/LFe3+孵育HEK293細胞可使alpha-synuclein-IRE-Luc轉染組熒光素酶的表達上調，與陰性對照組相比差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05);100 umol/L去鐵胺(deferoxamine mesylate，DFO)孵育HEK293細胞則alpha-synuclein-IRE-Luc轉染組熒光素酶的表達下調，與陰性對照組相比差別有統(tǒng)計學意義(p<0.05)，提示此類IRE具有鐵反應性；
　　 5、IR

10、P1的干涉載體pSilencerl.0-U6-IRP1與熒光素酶報告載體pRL-TK，alpha-synuclein-IRE-Luc共轉染HEK293細胞，降低細胞內IRP1表達水平后alpha-synuclein-IRE-Luc轉染組熒光素酶的表達上調，與陰性對照組相比差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；而IRP1的高表達載體pCMV6-AC-ACO1與pRL-TK，alpha-synuclein-IRE-Luc共轉染HEK293細胞增

11、加細胞內IRP1表達后則可下調熒光素酶的表達，與陰性對照組相比差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示插入的類IRE受細胞內IRP表達水平的調節(jié)；
　　 6、pSilencerl.0-U6－IRP1轉染SK-N-SH細胞后可使細胞內alpha-突觸核蛋白mRNA和蛋白水平均增加，與對照組相比差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05），同時轉染后細胞內alpha-突觸核蛋白的聚集較對照組明顯增多。
　　 上述實驗結果表明：細胞內鐵水平

12、可以通過氧化應激途徑誘導SK-N-SH細胞內alpha-突觸核蛋白聚集體的形成，VE完全阻斷氧化應激后并未完全緩解alpha-突觸核蛋白的聚集，提示氧化應激僅部分參與了鐵誘導alpha-突觸核蛋白聚集；構建的alpha-synuclein-IRE-Luc熒光素酶報告載體的轉錄受細胞內鐵水平和IRP1表達水平的調控，提示alpha-突觸核蛋白5’-UTR區(qū)的類IRE是一個功能性元件；細胞內的鐵可以通過IRE/IRP系統(tǒng)調控alpha-突觸