帕金森病相關(guān)蛋白DJ-1調(diào)控突觸核蛋白病理學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、Parkinson’sdiseaseassociatedproteinDJ1modulatestheexperimentalsynucleinopathiesinducedbyp—synucleinP123HADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanUnivers時(shí)inP抓ialFumllmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScien

2、ceBy≯多廠U歷口刀刀口刀SupeⅣisor：ProfWbiJiansheDate：May’2014摘要DJ1屑～RK7(Parkinsonprotein7)基因的缺失或突變，是引起的常染色體隱性早發(fā)性帕金森病(Pa出nson’sdiseaSe，PD)一個(gè)重要的原因。然而，DJ1突變體誘發(fā)帕金森病的原因仍未被人們了解。DS)，Il突變?cè)诩?xì)胞內(nèi)形成包涵體，加速神經(jīng)細(xì)胞退化。在誘導(dǎo)細(xì)胞變性的過程中DJ一1與BSyn突變體之間的聯(lián)系與自噬關(guān)

3、系還不清楚。所以我們的研究旨在穩(wěn)定表達(dá)BSynP123H的239T細(xì)胞中研究P123H與DJ1突變體的相互作用以及對(duì)神經(jīng)退化的影響。本實(shí)驗(yàn)首先通過PCR構(gòu)建DJ1野生型(DJ1wT)與兩步PCR構(gòu)建突變體的方法構(gòu)建L166P、D149A、A104T三個(gè)突變型的真核表達(dá)質(zhì)粒，通過質(zhì)粒全長(zhǎng)測(cè)序確定序列的正確性。使用帶有潮霉素抗性標(biāo)記的DSynP123H質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，使用推薦劑量200pg／mL的HygromycinB(潮霉素B)建

4、立抗性篩選的pSynP123H穩(wěn)定表達(dá)293T細(xì)胞模型。并在建立的DS)，11P123H突觸核蛋白細(xì)胞的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染DJ1野生型與DJ1突變型質(zhì)粒。其次，為確定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的表達(dá)情況，使用免疫印跡以及免疫熒光標(biāo)記，分別檢測(cè)DJ1的標(biāo)簽蛋白CMyc與DSynP123H，使用RealtimePCR檢測(cè)293T細(xì)胞模型內(nèi)DJ1與pS)rIl刪剛A的水平，確定細(xì)胞模型構(gòu)建成功。通過對(duì)線粒體的熒光標(biāo)記，加入FCCP帶來氧化應(yīng)激的刺激，測(cè)定細(xì)胞模型線粒體

5、對(duì)于氧化應(yīng)激的應(yīng)答水平。通過細(xì)胞的WST1活性分析，乳酸脫氫酶(LDH)的釋放測(cè)定細(xì)胞模型的活性，檢測(cè)DJ1與DSynP123H對(duì)于細(xì)胞的毒性影響。最后通過溶酶體的標(biāo)記M破er測(cè)定pS)，11P123H與DJ1和溶酶體的關(guān)系。研究Atg5、Becline1、LC3三種哺乳動(dòng)物的自噬相關(guān)基因的表達(dá)情況。檢測(cè)mTOR通路上的mTOR、p70S6K、4EBPl的磷酸化水平。使用自噬溶酶體和蛋白酶體的抑制劑確定pS)rIlP123H以及重組的D