人工合成多肽降解α-突觸核蛋白對帕金森病的治療作用.pdf

1、目的：
　　隨著研究深入，越來越多的證據(jù)表明：α-突觸核蛋白纖維性聚集體的產(chǎn)生是帕金森病發(fā)病的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)且大量的科學(xué)研究結(jié)果證實降低α-突觸核蛋白表達水平可有效的、特異性的治療帕金森病，然而當(dāng)其轉(zhuǎn)為臨床應(yīng)用時卻出現(xiàn)了很大阻礙。本論文通過人工合成多肽Tat-βsyn-degron，觀察其是否可通過蛋白酶體系統(tǒng)直接降解內(nèi)源性α-突觸核蛋白；并進一步研究該多肽是否對帕金森病具有保護作用及作用機制，為臨床帕金森病的治療提供新的理論基礎(chǔ)和

2、治療方案。
　　方法：
　　1.多肽的構(gòu)建和驗證:利用β-突觸核蛋白的第36-45個氨基酸可以高效特異地與α-突觸核蛋白結(jié)合的特點，及近來研發(fā)出的可通過蛋白酶體途徑快速且可逆的降解內(nèi)源性α-突觸核蛋白的特性，合成實驗肽Tat-βsyn-degron和相應(yīng)的對照肽Tat-βsyn。原代培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元給予不同濃度（5μM~50μM）的實驗肽（Tat-βsyn-degron peptide）和對照肽Tat-βsyn pept

3、ide（50μM）處理24hrs，用免疫印跡的方法檢測α-突觸核蛋白表達的變化；應(yīng)用蛋白酶抑制劑MG132（10μM）處理大鼠皮層神經(jīng)元24hrs，以探討人工合成的實驗肽對α-突觸核蛋白的作用及其機制；
　　2.用1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）(20μM)處理中腦腹側(cè)神經(jīng)元48hrs，將其作為研究多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)元載體。用實驗肽（Tat-βsyn-degron peptide）（25μM）和對照肽Tat-βsyn pept

4、ide（25μM）處理48hrs，后通過免疫印跡實驗方法檢測α-突觸核蛋白和酪氨酸羥化酶（TH）的表達變化；
　　3.構(gòu)建帕金森病動物模型，將C57BL/6(20~25g)小鼠隨機分為四組：Con組（Saline）、慢性MPTP組（MPTP），慢性MPTP加實驗肽組（MPTP+Tat-βsyn-degron）、慢性MPTP加對照肽組（MPTP＋Tat-βsyn）。每天給予腹腔注射帕金森毒性藥物1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四

5、氫吡啶（MPTP），連續(xù)5天，而對照組給予等量的生理鹽水。實驗肽（Tat-βsyn-degron peptide）（6μmol/kg）和對照肽（Tat-βsyn peptide）（6μmol/kg）每12hr給藥一次，與MPTP同日給藥，且在MPTP給藥完成后繼續(xù)給藥7天。所有實驗鼠給藥完成后通過：
　　1）平衡疲勞轉(zhuǎn)動棒行為學(xué)測試，檢測多肽對帕金森病樣行為的改善作用；
　　2）免疫印跡實驗檢測紋狀體內(nèi)α-突觸核蛋白以及酪氨

6、酸羥化酶（TH）表達的變化；
　　3）免疫組化實驗檢測紋狀體和黑質(zhì)區(qū)酪氨酸羥化酶（TH）的表達變化。
　　結(jié)果：
　　1.人工合成的多肽可以通過蛋白酶體途徑有效的降解內(nèi)源性α-突觸核蛋白，且具有劑量依賴性和時間依賴性；
　　2.體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，實驗肽可以有效降解內(nèi)源性α-突觸核蛋白的水平，對MPP+所致多巴胺能神經(jīng)元毒性損傷具有保護作用；然而對照肽雖在降解α-突觸核蛋白方面未能發(fā)揮效能，但是卻表現(xiàn)出了微弱的神經(jīng)

7、元保護作用，我們推測這一神經(jīng)元保護效能可能是由于對照肽抑制了α-突觸核蛋白的聚合。
　　3.體內(nèi)實驗研究表明：
　　1）實驗肽明顯降解了紋狀體內(nèi)的α-突觸核蛋白，而對照肽并未發(fā)揮此作用；
　　2）實驗肽對MPTP所誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元的損傷具有保護作用；
　　3）實驗肽可以有效改善MPTP所致的帕金森病模型鼠的行為學(xué)缺陷。
　　結(jié)論：
　　1.人工合成的多肽可以穿透細胞質(zhì)膜，通過蛋白酶體系統(tǒng)有效的、高