晚期糖基化終末產(chǎn)物和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF信號(hào)通路的影響及其機(jī)制探討.pdf

1、目的:以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation endproducts，AGEs)干預(yù)以及人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stemcells，hMSCs)與HUVEC共培養(yǎng)，應(yīng)用Western blot、PCR等方法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular end

2、othelial growth factor，VEGF）及其受體和下游PI3K/AKT/eNOS信號(hào)通路的表達(dá)變化，探討VEGF信號(hào)通路在糖尿病大血管病變血管新生障礙中的病理改變和機(jī)制以及間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)糖尿病患者血管新生促進(jìn)作用的影響機(jī)制。
　　方法:人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分三組:AGE組、AGE+MSC共培養(yǎng)組，空白對(duì)照組（不加任何刺激因素）。對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)HUVEC;

3、 AGE組以400ug/ml濃度的AGE與HUVEC共孵育36小時(shí)（已經(jīng)通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定AGE最佳干預(yù)濃度和干預(yù)時(shí)間，具體見后。）;AGE+MSC共培養(yǎng)組在400ug/ml AGE環(huán)境下將MSC與HUVEC共培養(yǎng)36小時(shí)。36小時(shí)后提取各組HUVEC的蛋白和mRNA并留取細(xì)胞培養(yǎng)上清液備用。采用Westernblot、PCR方法檢測(cè)3組內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF、VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flk-1)、sFlt-1(s

4、oluble VEGFR-1)、p-AKT、p-eNOS的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組之間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05即認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、AGE影響VEGF-A和VEGFR的表達(dá)
　　AGE干預(yù)后，內(nèi)皮細(xì)胞VEGFA、sFlt-1 mRNA表達(dá)（3.747±0.415）與對(duì)照組（1.007±0.139）相比升高，差異有

5、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);VEGFR-2mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　　400ng/ml AGE干預(yù)36小時(shí)后，內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR-1蛋白表達(dá)（93.129±4.620）與對(duì)照組（557.395±9.383）相比下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);VEGFR-2蛋白表達(dá)(63.791±7.98)與對(duì)照組（571.995±12.65）相比下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　

6、2、AGE影響PI3K/AKT/eNOS信號(hào)通路的表達(dá)
　　400ng/ml AGE干預(yù)36小時(shí)后，內(nèi)皮細(xì)胞p-AKT蛋白表達(dá)（86.408±3.255）與對(duì)照組（482.325±39.859）相比減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;p-eNOS蛋白表達(dá)（187.69±20.732）與對(duì)照組(426.96±50.063)相比亦減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3、與MSC共培養(yǎng)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR的表達(dá)的影響

7、
　　AGE干預(yù)后，內(nèi)皮細(xì)胞sFlt-1 mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比升高，經(jīng)與MSC共培養(yǎng)后，sFlt-1 mRNA（2.048±0.245）表達(dá)與AGE組相比下降（P＜0.05）;
　　AGE干預(yù)后，內(nèi)皮細(xì)胞表面VEGFR-1與正常對(duì)照組相比表達(dá)下降，經(jīng)與MSC共培養(yǎng)后，VEGFR-1（319.43±3.649）蛋白表達(dá)與AGE組相比升高(P＜0.05);AGE干預(yù)后，內(nèi)皮細(xì)胞表面VEGFR-2與正常對(duì)照組相比表達(dá)明顯下降，

8、經(jīng)與MSC共培養(yǎng)后，VEGFR-2（202.81±48.879）蛋白表達(dá)與AGE組相比升高(P＜0.05)。
　　4、與MSC共培養(yǎng)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞PI3K/AKT/eNOS信號(hào)通路的表達(dá)的影響
　　AGE干預(yù)后，p-AKT、p-eNOS與正常對(duì)照組相比表達(dá)明顯減弱，經(jīng)與MSC共培養(yǎng)后，p-AKT蛋白表達(dá)（238.385±30.384）與AGE組相比升高(P＜0.05)，p-eNOS蛋白表達(dá)（255.545±9.227）與AGE組