VEGF對(duì)人骨髓和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中內(nèi)皮細(xì)胞組分的影響.pdf

1、目的:
　　1.比較人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSC)和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSC)中的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)及內(nèi)皮細(xì)胞(EC)的比例。
　　2.探討血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)對(duì)MSC中的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)及內(nèi)皮細(xì)胞(EC)比例的影響。
　　方法:
　　1.UC-MSC的分離培養(yǎng):無菌條件下將新鮮臍帶剪至1-2mm,利用植塊法分離出貼壁細(xì)胞,置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),約1周后貼壁細(xì)胞鋪滿80%

2、瓶底,用0.25%胰蛋白酶消化后,以5×104個(gè)/cm2細(xì)胞密度傳代培養(yǎng)。
　　2.BM-MSC的分離培養(yǎng):取成人骨髓3ml,使用淋巴細(xì)胞分離液采用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞,置于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng),約2周后貼壁細(xì)胞鋪滿80%瓶底,用0.25%胰蛋白酶消化后,以5×104個(gè)/cm2細(xì)胞密度傳代培養(yǎng)。
　　3.實(shí)驗(yàn)分組:將細(xì)胞分為兩組:對(duì)照組不加VEGF;實(shí)驗(yàn)組加VEGF,濃度為10ng/ml。
　　4.取第

3、5代穩(wěn)定生長(zhǎng)的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀進(jìn)行免疫表型鑒定,檢測(cè)EC標(biāo)志CD34+CD133+和vWF+CD31+雙陽性細(xì)胞的比例。
　　5.瑞氏染色法觀察加入VEGF后細(xì)胞形態(tài)的變化。
　　6.利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮祖細(xì)胞表面標(biāo)志CD34、CD133、CD31、vWF的表達(dá)情況。
　　7.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法觀察VEGF對(duì)EC標(biāo)志性基因表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.原代培養(yǎng)7-8天后顯微鏡下可見貼壁生

4、長(zhǎng)的細(xì)胞,成纖維狀,15天時(shí)細(xì)胞可融合至80%,變?yōu)樾螒B(tài)均一的紡錘形。傳代2～3次后能獲得形態(tài)均一的細(xì)胞,排列呈放射狀或旋渦狀。
　　2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:BM-MSC和UC-MSC中各存在少量EC及內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC),經(jīng)VEGF作用后,EC比例上升而EPC比例下降。
　　3.瑞氏染色顯示加入vEGF后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,MSC的長(zhǎng)寬比變大。
　　4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明,加入VEGF后EC相關(guān)標(biāo)志基因Ti