自噬對糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的作用.pdf

1、目的：
　　 自噬(Autophagy)由Ashford和Porter在1962年發(fā)現(xiàn)。自噬是普遍存在的生命現(xiàn)象，并與凋亡有著密切的聯(lián)系。細(xì)胞通過形成自噬溶酶體降解胞內(nèi)費(fèi)用的蛋白及破損的細(xì)胞器。近年，自噬同慢性退行性疾病如骨性關(guān)節(jié)炎，骨質(zhì)疏松的關(guān)系引起廣泛關(guān)注。糖基化終末產(chǎn)物(Adavanced glycation end products，AGEs)是長壽命大分子蛋白質(zhì)與葡萄糖的無酶促反應(yīng)產(chǎn)物。人體AGEs含量隨年齡的增加以及

2、在病理狀態(tài)(糖尿病，腫瘤等)大幅增加。羧甲基賴氨酸(CML)是AGEs重要的結(jié)構(gòu)特征和主要的作用位點(diǎn)。ROS(Reactive oxygen species)是AGEs病理過程中重要的中間媒介。骨組織中富含長壽命蛋白質(zhì)，所以更容易受到AGEs的影響。大量研究表明AGEs能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的凋亡。本研究的目的：1、AGEs作用下成骨細(xì)胞的自噬水平的變化。2、自噬對AGEs誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡的作用3氧化應(yīng)激在AGEs處理的成骨細(xì)胞凋亡與自噬過

3、程中的作用。
　　 方法：
　　 制備AGE并用羧甲基賴氨酸(CML)的ELISA試劑盒檢測CML的濃度。用MTT法檢測不同濃度AGEs處理后MC3T3-E1細(xì)胞增殖率的變化，篩選出合適的作用濃度。用Western-blot以及免疫熒光檢測不同時(shí)間AGEs處理后的MC3T3-E1內(nèi)自噬水平改變。自噬對AGEs誘導(dǎo)凋亡的作用通過流式細(xì)胞儀檢測自噬誘導(dǎo)劑或自噬抑制劑與AGEs共同作用下MC3T3-E1細(xì)胞的ANNEXIN-V

4、和PI染色變化情況。細(xì)胞內(nèi)ROS以及線粒體膜電位的改變分別應(yīng)用DCFH-DA和JC-1試劑盒來檢測。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各組間比較采用單因素方差分析，樣本均數(shù)間的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有顯著性。
　　 結(jié)果：
　　 在AGEs處理的MC3T3-E1中，自噬表達(dá)較正常細(xì)胞增加，并具有時(shí)間依賴性。自噬的誘導(dǎo)劑可以明顯的抑制AGEs作用的MC3T3-E1

5、凋亡，反之，自噬的抑制劑進(jìn)一步加重了MC3T3-E1的凋亡。自噬誘導(dǎo)劑能夠使得AGEs處理的MC3T3-E1細(xì)胞中ROS水平降低及線粒體損傷減少；自噬的抑制劑能夠使得MC3T3-E1細(xì)胞中ROS水平增加及線粒體的損傷增加。在ROS的抑制劑與AGEs混合處理的MC3T3-E1中其自噬表達(dá)較AGEs單獨(dú)組明顯減低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.自噬在AGEs處理的成骨細(xì)胞中普遍表達(dá)，并且隨著AGEs作用時(shí)間的