TRB3在糖基化終末產(chǎn)物誘導的胰島β細胞氧化損傷和凋亡中的作用及機制研究.pdf

1、2型糖尿病的發(fā)病過程中許多細胞外環(huán)境因素如高血糖，高游離脂肪酸，炎癥性細胞因子，淀粉樣物質(zhì)等均可導致的β細胞損傷并發(fā)生凋亡。最近研究表明在糖尿病的發(fā)病過程中，糖基化終末產(chǎn)物（Advancedglycationend products, AGEs）通過糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)也能夠?qū)Ζ录毎斐蓳p傷，可能是導致胰島β細胞功能衰竭和數(shù)量減少的因素之

2、一。機體內(nèi)血糖水平升高時AGEs生成反應加速在體內(nèi)積累，并對組織和細胞造成損傷效應。但目前AGEs導致β細胞損傷的具體分子機制還不十分清楚。
　　Tribbles同源蛋白3（Tribbles homolog3，TRB3）是一種不具有激酶活性，但是可以作為腳手架蛋白樣調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)多種信號轉(zhuǎn)導因子，參與調(diào)節(jié)多條信號轉(zhuǎn)導通路能夠發(fā)揮廣泛的生物學功能。TRB3在胰島素靶組織表達，通過干擾胰島素通路參與了外周胰島素抵抗的發(fā)生。此外，TRB3

3、可以被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導凋亡中重要的介導因子C/EBP同源蛋白(C/EBP homology protein，CHOP)誘導表達，并參與促進細胞凋亡，但是其促凋亡作用存在爭議。我們以往研究發(fā)現(xiàn)，TRB3在胰島β細胞凋亡中起到重要作用。在高糖、高脂和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激均通過上調(diào)TRB3介導胰島β細胞凋亡。是否TRB3也參與了AGEs引起的胰島β細胞損傷值得研究。
　　研究目的：
　　通過檢測糖尿病動物模型體內(nèi)AGEs水平和胰島細胞中TRB

4、3的表達情況，以及體外AGEs刺激條件下胰島β細胞系INS-1細胞中TRB3的表達情況，并通過基因過表達或干擾，研究TRB3對AGEs誘導的INS-1細胞氧化損傷和凋亡的影響，探討TRB3在AGEs誘導β細胞氧化損傷和凋亡中的作用及機制。
　　研究方法：
　　分析TRB3與AGEs水平及細胞凋亡的關(guān)系:
　　體內(nèi)實驗:采集糖尿病發(fā)病不同階段（第0月、3月、6月和9月）的GK大鼠血清，應用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme

5、linked immunosorbent assay, ELISA)檢測血清中AGEs水平;分離純化GK大鼠胰島，應用Caspase-Glo3/7凋亡酶活性檢測試劑盒評估胰島細胞凋亡情況，應用Real-time PCR和Western blot檢測GK大鼠胰島細胞RAGE和TRB3表達水平，以初步判斷TRB3表達與AGEs水平及胰島細胞凋亡的相關(guān)性。
　　體外實驗:采用200 ug/mlAGEs刺激INS-1細胞48 h后，應用C

6、CK-8法檢測細胞存活率，應用TUNEL染色及流式細胞儀檢測AnnexinⅤ-FITC/PI觀察AGEs對 INS-1細胞凋亡的影響;應用Real-time PCR和Western blot檢測細胞中RAGE、TRB3的表達水平。
　　分析TRB3介導AGEs對INS-1細胞損傷作用的機制:
　　應用Real-time PCR和Western blot檢測AGEs處理后INS-1中RAGE、TRB3和NADPH氧化酶4(ni

7、cotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase4，NOX4)的表達水平;應用活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒評估細胞中ROS水平。
　　采用tet-on系統(tǒng)建立可誘導TRB3過表達的INS-1細胞，采用慢病毒載體介導的shRNA干擾法建立TRB3穩(wěn)定敲降的INS-1細胞。檢測TRB3過表達或敲降對細胞凋亡、NOX4 mRNA或蛋白質(zhì)表達水

8、平及細胞中ROS水平的影響。
　　分析TRB3對PKC信號通路的影響:
　　采用AGEs刺激INS-1細胞后，應用Western blot檢測TRB3敲降對AKT的磷酸化水平、PKCδ的核轉(zhuǎn)位及PKCβ2膜轉(zhuǎn)位的影響。采用PKCβ2抑制劑LY333531處理INS-1細胞后，評估抑制PKCβ2活性對細胞凋亡、細胞中NOX4的表達和ROS水平的影響。
　　研究結(jié)果：
　　糖尿病GK大鼠血清AGEs的水平隨著糖尿病病

9、程的延長而進行性升高，發(fā)病6個月后明顯高于Wistar大鼠。此時，GK大鼠胰島細胞中Caspase3/7凋亡酶活性增強，RAGE和TRB3的表達水平增高。
　　CCK-8實驗結(jié)果顯示，200 ug/ml的AGEs處理INS-1細胞48h后細胞的存活率為明顯低于對照組。同時細胞凋亡水平增高，TUNEL染色陽性細胞在AGEs組明顯高于對照組，AnnexinⅤ-FITC/PI的流式細胞術(shù)結(jié)果也同時顯示AGEs組凋亡率為明顯高于對照組。細

10、胞內(nèi)RAGE、TRB3和NOX4的表達水平升高;細胞內(nèi)ROS含量增加。
　　TRB3過表達后，AGEs誘導的細胞凋亡增加，細胞內(nèi)ROS的水平均增高。敲降TRB3的表達之后，AGEs誘導的細胞凋亡減少，細胞內(nèi)NOX4的表達及ROS的水平明顯降低。
　　進一步研究發(fā)現(xiàn)，伴隨著TRB3的表達上調(diào)PKCβ2表達水平增高，同時，膜轉(zhuǎn)位增加;敲降TRB3后PKCβ2表達水平下降和膜轉(zhuǎn)位減少。而給予PKCβ2特異性抑制劑也能夠減少AGEs