高糖及糖基化終末產(chǎn)物刺激足細(xì)胞產(chǎn)生微囊泡的初步研究.pdf

1、目的:
　　本研究以小鼠腎小球足細(xì)胞MPC-5為模型，研究高糖和糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)刺激MPC-5后能否增加微囊泡(microvesicles，MV)的產(chǎn)生及其可能機(jī)制。
　　方法:
　　以體外培養(yǎng)的MPC-5細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?0mM葡萄糖作為高糖組刺激因素、200nM AGEs作為AGEs組刺激因素（刺激時(shí)間均為20小時(shí)）?？寡趸瘎㎞-乙酰半胱氨

2、酸(N-Acetyl-L-cysteine，NAC)及α-硫辛酸(alpha lipoic acid，α-LA)作為預(yù)處理因素（均提前1小時(shí)處理）。
　　1.采用ELISA技術(shù)檢測(cè)MPC-5細(xì)胞產(chǎn)生MV的含量。
　　2.以CM-H2DCFDA為探針，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)高糖、AGEs刺激不同時(shí)間后細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量的變化。
　　3.以MitoSOXTM為探針，采用流

3、式細(xì)胞儀檢測(cè)高糖及AGEs刺激MPC-5細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)后線(xiàn)粒體內(nèi)ROS含量的變化。
　　4.采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)高糖及AGEs刺激MPC-5細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)后NOX4蛋白的表達(dá)。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。兩組以上比較采用單因素方差分析(ANOVA)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)是α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1

4、.MV定量檢測(cè)結(jié)果:與對(duì)照組相比，30mM葡萄糖與200nM AGEs分別刺激MPC-5細(xì)胞20小時(shí)后MV產(chǎn)生顯著增多(P＜0.05)，分別為對(duì)照組的4.6倍、7.6倍;抗氧化劑NAC預(yù)處理1h后，MV含量明顯低于高糖組(P＜0.05)，下降了52.9％，AGEs+NAC組MV含量也明顯低于A(yíng)GEs組(P＜0.05)，下降了48.9％;α-LA預(yù)處理小時(shí)后高糖+α-LA組MV含量與高糖組相比無(wú)明顯變化(P＞0.05)，AGEs+α-LA

5、組MV含量與AGEs組比也無(wú)明顯變化(P＞0.05)。
　　2.細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)結(jié)果:30mM葡萄糖刺激MPC-5細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生量呈先升高后降低趨勢(shì)，12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)分別是0小時(shí)的1.8、3.0、4.0、2.0倍(p＜0.05)，可見(jiàn)48小時(shí)達(dá)高峰，而后逐步下降;200nMAGEs刺激MPC-5細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生量呈先升高后降低趨勢(shì)，12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)分別是0小時(shí)的2.

6、3、3.8、5.2、4.8倍(p＜0.05)，可見(jiàn)48小時(shí)達(dá)高峰，而后逐步下降。
　　3.線(xiàn)粒體內(nèi)ROS檢測(cè)結(jié)果:30mM葡萄糖刺激MPC-5細(xì)胞后，線(xiàn)粒體內(nèi)ROS的產(chǎn)生量呈先升高后降低趨勢(shì)，4小時(shí)、12小時(shí)分別是0小時(shí)的2.0、1.3倍(p＜0.05)，可見(jiàn)4小時(shí)達(dá)高峰，而后逐步下降，在24小時(shí)時(shí)降低至基線(xiàn)水平;200nM AGEs刺激MPC-5細(xì)胞后，線(xiàn)粒體內(nèi)ROS的產(chǎn)生量呈先升高后降低趨勢(shì)，4小時(shí)、12小時(shí)分別是0小時(shí)的3.

7、3、1.4倍(p＜0.05)，可見(jiàn)4小時(shí)達(dá)高峰，而后逐步下降，在24小時(shí)時(shí)降低至基線(xiàn)水平。
　　4.足細(xì)胞NOX4蛋白檢測(cè)結(jié)果:與對(duì)照組相比，隨高糖刺激時(shí)間延長(zhǎng)NOX4蛋白表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)時(shí)分別是0小時(shí)的3.0、1.9、1.5倍(p＜0.05)，可見(jiàn)4小時(shí)達(dá)高峰，隨后逐漸下降，24小時(shí)時(shí)降低至基礎(chǔ)水平;隨AGEs刺激時(shí)間延長(zhǎng)，NOX4蛋白表達(dá)量也呈先升高后降低趨勢(shì)，12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、