自噬在糖基化終末產(chǎn)物抑制破骨細(xì)胞形成和功能中的作用.pdf

1、目的:糖尿病性骨質(zhì)疏松嚴(yán)重影響人們的健康和生活，糖尿病或高血糖狀態(tài)與糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)的形成密切相關(guān)，而不同濃度的AGEs對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的作用不盡相同，并且可導(dǎo)致骨強(qiáng)度降低、骨脆性增加以及骨質(zhì)疏松。但是，明確AGEs對(duì)破骨細(xì)胞形成和功能的影響以及明確自噬在AGEs影響破骨細(xì)胞形成和功能中的作用對(duì)于糖尿病性骨質(zhì)疏松的治療有一定的意義。
　　方法:以RAW2

2、64.7細(xì)胞作為破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，在鋪板后第二天加入RANKL(receptor activator for nuclear factor-B ligand)和M-CSF(macrophagecolony-stimulating factor)等誘導(dǎo)破骨細(xì)胞產(chǎn)生。觀察和檢測(cè)不同濃度AGEs作用下破骨細(xì)胞的形成和功能，并用氯喹和雷帕霉素分別抑制和激活自噬后，觀察破骨細(xì)胞的形成和功能。1、通過(guò)CCK-8（Cell Counting Kit

3、-8）試劑盒檢測(cè)不同AGEs濃度下RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞活力;2、通過(guò)TRAP(Tartrate resistant acid phosphatase)染色鑒定破骨細(xì)胞的形成，并檢測(cè)不同AGEs濃度以及自噬對(duì)破骨細(xì)胞形成的影響;3、通過(guò)western blot檢測(cè)不同AGEs濃度下LC3、p62以及Cathepsin K等蛋白的表達(dá)差異;4、通過(guò)LC3免疫熒光染色鑒定細(xì)胞內(nèi)的自噬強(qiáng)度，MDC(Monodansylcadaverine

4、)免疫熒光試驗(yàn)作為一個(gè)輔助試驗(yàn)用以檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬泡的形成;5、通過(guò)利用Osteo Assay Surface檢測(cè)不同干預(yù)因素下的骨吸收差異。
　　結(jié)果:1、未發(fā)現(xiàn)0mg/l（對(duì)照組），50 mg/l，100 mg/l，150 mg/l，200 mg/l的AGEs以及100mg/l的牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)對(duì)RAW264.7細(xì)胞有毒性作用;2、0mg/l-200mg/l的AGEs濃度內(nèi)，隨著A

5、GEs濃度的升高，Cathepsin K的表達(dá)量降低，100mg/l的AGEs與對(duì)照組相比，TRAP染色后破骨細(xì)胞的形成數(shù)量減少，骨吸收面積減少;3、在氯喹的作用下，TRAP染色后破骨細(xì)胞的形成較對(duì)照組減少且骨吸收面積減少，而在雷帕霉素的作用下，TRAP染色后破骨細(xì)胞的形成較對(duì)照組增加且骨吸收面積增加;4、0mg/l-200mg/l的AGEs濃度下，隨著AGEs濃度的升高，LC3Ⅱ/β-actin數(shù)值降低而p62/β-actin數(shù)值增加