人脂肪細胞中PGC-1的表達及調(diào)控攜帶PGC-1和PGC-1 siRNA慢病毒載體的構(gòu)建與表達.pdf

1、第一部分 人脂肪細胞中PGC-1的表達及調(diào)控 目的：胰島素抵抗(insulin resistance，IR)貫穿于2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的整個過程，是2型糖尿病發(fā)病的重要基礎(chǔ)。而脂肪組織在胰島素抵抗的發(fā)生中起著重要作用，很多資料顯示，肥胖與胰島素抵抗有高度相關(guān)性。而且，脂肪組織作為新的內(nèi)分泌器官，分泌的一些激素和細胞因子與胰島素抵抗密切相關(guān)。 過氧化物酶體增生激活受體γ協(xié)同刺激因子α(PGC-1)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)

2、錄協(xié)同刺激因子。它被認為在適應(yīng)性產(chǎn)熱、線粒體生成、脂肪酸β氧化及肝糖異生等過程中有著重要作用。肝臟中的PGC-1表達增加，能增加肝糖輸出，促進糖異生；肌肉組織中的PGC-1可增加GLUT4的表達，通過增強葡萄糖的轉(zhuǎn)運，降低血糖。 對于PGC-1與糖尿病的關(guān)系得研究，主要集中在肝臟和肌肉。而關(guān)于脂肪組織的研究尚少，因此，本研究主要觀察PGC-1在糖尿病人及正常人脂肪組織中的表達，PGC-1在體外培養(yǎng)的脂肪細胞中的表達及其調(diào)控因素。

3、另外，我們還構(gòu)建了PGC-1的慢病毒表達載體及PGC-1 siRNA的慢病毒載體，觀察轉(zhuǎn)染這些構(gòu)建的慢病毒后對脂肪細胞中PGC-1下游基因的影響。 方法：RT-PCR和Western-blot檢測糖尿病人和正常人皮下脂肪組織中PGC-1的表達；流式細胞儀和油紅染色鑒定ADSCs和分化成熟的脂肪細胞；RT-PCR和Western．blot檢測TNF-α和吡咯列酮對脂肪細胞中PGC-1的影響；將PGC-1慢病毒和PGC-1 siR

4、NA慢病毒分別轉(zhuǎn)染脂肪細胞，R1-PCR觀察轉(zhuǎn)染病毒后對脂肪細胞中PPAR-γ和GLUT4的影響。 結(jié)果：糖尿病人和正常人相比，皮下脂肪組織中PGC-1的表達顯著升高；1ng/ml的TNF-α刺激脂肪細胞后，隨著時間的延長，PGC-1的表達增加。而10ng/ml的TNF-α刺激脂肪細胞后，隨著時間的延長，PGC-l的表達下降；吡咯列酮處理脂肪細胞后，PGC-1的表達呈時間依賴性增加；PGC-l慢病毒轉(zhuǎn)染脂肪細胞后，PPAR-γ

5、和GLUT-4的表達增加。PGC-1 siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染脂肪細胞后，PPAR-γ和GLUT-4的表達下降。 結(jié)論：糖尿病人外周皮下脂肪中PGC-l的表達升高；TNF-α和吡咯列酮參與對脂肪細胞中PGC-1的調(diào)控；脂肪細胞中PGC-1能夠促進PPAR-γ和GLUT-4的表達。 第二部分攜帶PGC-1和PGc-1 siRNA慢病毒載體的構(gòu)建與表達 目的：過氧化物酶體增生激活受體γ協(xié)同刺激因α(PGC-1)是近年來發(fā)

6、現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄協(xié)同刺激因子。它在不同的細胞發(fā)揮著不同的作用。慢病毒載體因為能夠轉(zhuǎn)染非分裂期細胞和分裂期細胞，攜帶的遺傳信息能夠整合到宿主的基因組，實現(xiàn)目的基因長期穩(wěn)定的表達而成為應(yīng)用范圍日益廣泛的病毒載體。因此我們構(gòu)建了PGC-1慢病毒表達載體和：PGC-1 siRNA慢病毒載體，觀察轉(zhuǎn)染病毒后對ADSCs及脂肪細胞的影響。 方法：將PGC-1全長克隆到pWPXL質(zhì)粒，PGC-1 siRNA連接到pLVTHM質(zhì)粒。包裝病毒后，流式

7、細胞儀檢測病毒滴度；MTT和流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染病毒后對細胞的影響；RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染病毒后PGC-1的表達。 結(jié)果：隨著病毒滴度的增加，轉(zhuǎn)染效率逐漸增加。病毒滴度為0.1和0.5時，對細胞增殖有輕度刺激作用，對細胞凋亡沒有影響。病毒滴度升高后，轉(zhuǎn)染早期能抑制細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡。PGC-1慢病毒載體能夠升高脂肪細胞中PGC-1的表達，PGC-1 siRNA慢病毒載體能夠抑制脂肪細胞中PGC-1的表達結(jié)論：慢病毒載體能夠長期有