中國斗雞cDNA文庫的構(gòu)建及DJ-1和ANP基因的表達研究.pdf

1、中國斗雞是我國重要的地方家禽品種資源，育成歷史悠久，馳名中外。中國斗雞不僅斗性強，具有可觀賞性和娛樂性，而且肉用性能突出，生長快，肉質(zhì)鮮美，且具有很好的食補作用，利用價值頗大。然而，由于以前對中國斗雞保護的不夠，所以造成該品種的數(shù)量銳減。因此，為保護我國珍惜的畜禽品種，一種有效的方法就是利用構(gòu)建的cDNA文庫保存中國斗雞的功能基因。在本研究中構(gòu)建了中國斗雞心臟組織cDNA文庫，成功從文庫中克隆了DJ-1基因與ANP基因，順利構(gòu)建了DJ-

2、1基因與ANP基因的原核和真核表達載體，并進行原核真核表達研究。提取中國斗雞心臟組織總RNA，并對RNA質(zhì)量進行測定，運用SMARTTM技術(shù)成功建成了中國斗雞心臟組織全長cDNA文庫。經(jīng)過文庫質(zhì)量鑒定，該文庫未擴增時滴度為3.32×106pfu/mL，經(jīng)過宿主菌體外擴增后，文庫的滴度達到1.01×1010 pfu/mL。為鑒定文庫中cDNA片段的插入率和片段大小，隨機挑取文庫中100個單克隆菌斑進行PCR鑒定，結(jié)果顯示文庫中cDNA片段

3、的插入率為97.0％，平均插入片段大小約為1.1kb。中國斗雞cDNA文庫的建成可以為高通量的篩選本物種的基因和發(fā)現(xiàn)新基因奠定基礎(chǔ)，更重要的是在分子水平對我國特有的寶貴畜禽品種的保存具有更長遠的意義。
　　 研究中從所建的cDNA文庫中克隆了DJ-1和ANP基因的CDS區(qū)，并且通過雙酶切使其定向插入到了原核表達載體pGEX-4T-1，通過設(shè)置不同的IPTG誘導(dǎo)劑濃度和不同的表達時間進行原核表達，同時篩選兩個融合蛋白的最有表達條件

4、，與對照組相比，pGEX-4T-1-DJ-1與pGEX-4T-1-ANP的實驗組在46kD與43.4kD的位置出現(xiàn)DJ-1與ANP融合蛋白的表達帶，表明DJ-1與ANP基因在BL21菌中表達成功。
　　 利用相同的雙酶切方法構(gòu)建了DJ-1和ANP基因的四個真核表達載體（分別為pEGFP-N3-DJ-1、pEYFP-N1-DJ-1、pDsRedl-N1-DJ-1和pEGFP-N3-ANP）。真核表達采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，將以上四個重組真

5、核表達載體成功轉(zhuǎn)入脂尾羊成纖維細胞中。通過共聚焦顯微鏡研究這兩個基因融合蛋白的表達情況和亞細胞定位。分別觀察轉(zhuǎn)染24、48和72h后三個時期的表達情況，結(jié)果表明，構(gòu)建的DJ-1和ANP基因的重組載體表達的重組融合蛋白的轉(zhuǎn)染率分別為12.5％～38.7％之間和17.9％～37.6％之間。DJ-1基因重組融合蛋白在脂尾羊成纖維細胞的細胞核與細胞質(zhì)均有分布，而且細胞質(zhì)中表達始終強于細胞核，轉(zhuǎn)染24h后熒光強度較弱，表達量較少，48h達到表達峰