大熊貓Leptin、Ghrelin和IL-15基因的克隆表達(dá)及胃和脾臟cDNA文庫的構(gòu)建.pdf

1、浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士學(xué)位論文大熊貓Leptin、Ghrelin和IL-15基因的克隆表達(dá)及胃和脾臟cDNA文庫的構(gòu)建姓名：徐慶剛申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：遺傳學(xué)指導(dǎo)教師：朱睦元20090301浙江大學(xué)博士學(xué)位論文的條件，探索了用硫酸銨分級沉淀純化表達(dá)產(chǎn)物的方法；然后采用優(yōu)化的表達(dá)系統(tǒng)和純化方法，實現(xiàn)了大熊貓L e p t i n 和I n t e r l e u k i n ．1 5 在酵母表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)，用親和柱對表達(dá)蛋白的純化

2、。L e p t i n 基因含有5 個A G G ，1 個A G A ，1 個A T A ；兒．，J 基因含有3 個A T A ，一個T G T 。這些密碼子都是大腸桿菌稀有密碼子。在單獨使用B L 2 1 ( D E 3 ) - p E T 2 8 a - g e n e 表達(dá)系統(tǒng)時，菌株會生長會受到抑制，很難獲得表達(dá)。本研究將質(zhì)粒p S J S l 2 4 0 和p E T 2 8 a - L e p t i n 或p E T 2

3、 8 a - 1 L 1 5 共轉(zhuǎn)化到E ．c o l i B L 2 1( D E 3 ) 菌株，k a n 和S P 抗生素篩選，得到過表達(dá)菌株B L 2 1 ( D E 3 )( p S J S l 2 4 0 ／p E T 2 8 a - L e p t i n ) 和B L 2 1 ( D E 3 ) ( p S J S l 2 4 0 ／p E T 2 8 a - I L l 5 ) ，使這兩個含大量稀有密碼子的基因在大腸桿

4、菌中獲得成功表達(dá)；為這三個大熊貓基因的體外表達(dá)創(chuàng)建了技術(shù)平臺，為深入研究基因功能奠定了基礎(chǔ)。3 ．用R T - P C R 方法檢測了G h r e l i n 在小腸、肝臟、腎臟、胸腺、脾臟和心臟組織的m R N A 表達(dá)，表明大熊貓G h r e l i n 的最主要表達(dá)組織是胃，在小腸、肝臟和腎臟中只有較弱表達(dá)，而在胸腺、脾臟和心臟組織中沒有檢測到該基因的表達(dá)。另外，采用W e s t e r n 方法檢測了表達(dá)的大熊貓I L ．

5、1 5 蛋白的免疫原性，結(jié)果表明I L ．1 5 具有作為大熊貓疫苗佐劑的潛力；L e p t i n 可以作為大熊貓L e p t i n 缺乏引起的各種疾病的防治，應(yīng)用于人工繁育大熊貓。4 ．構(gòu)建了胃和脾臟的全長c D N A 文庫。初級文庫的滴度分別為3 ．3 ×1 0 6 和4 ．3 ×1 0 6 ；重組率分別達(dá)到8 5 ％和8 2 ％；擴增文庫的滴度分別為6 ．9 ×1 0 9 和6 ．4