大熊貓等瀕危動物FSH-LH和GH-GHR基因的克隆及其表達(dá)研究.pdf

1、該研究針對大熊貓為主的瀕危動物繁殖率低的兩大主要問題,以大熊貓、小熊貓和東北虎為研究對象,開展了在動物生長發(fā)育和生殖過程中發(fā)揮重要作用的促性腺激素(FSH/LH)、生長激素及其受體(GH/GHR)的基因克隆、序列分析和表達(dá)研究,并探討了今后生物工程生產(chǎn)大熊貓等瀕危動物FSH/LH和GH用于人工繁殖實(shí)踐的意義和可能性.主要結(jié)果如下:1.利用RT-PCR技術(shù)從垂體組織擴(kuò)增出大熊貓促性腺激素α、FSHβ和LHβ亞基編碼區(qū)序列,它們分別編碼12

2、0、129和141氨基酸的前體蛋白質(zhì),預(yù)測的分子量分別為13.6kD,14.6kD和15kD.2.將構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA/α分別與pcDNA/FSHβ和pcDNA/LHβ共轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞,進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá).RT-PCR檢測,表明三個(gè)亞基因在COS7細(xì)胞中得到正常轉(zhuǎn)錄.3.構(gòu)建大熊貓α,FSHβ和LHβ亞基基因的原核表達(dá)載體pGEX-α,pGEX-FSHβ和pGEX-LHβ,IPTG誘導(dǎo)后在BL21宿主菌中得到高效融合表達(dá),表達(dá)的融

3、合蛋白GST-α,GST-FSHβ和GST-LHβ的分子量分別為36kD、38kD和41kD,并以不溶的包涵體形式存在于細(xì)胞中.無法直接用谷胱甘肽-瓊脂糖親和層析柱純化.4.克隆并測序小熊貓α和LHβ亞基的編碼區(qū)序列,相似于大熊貓序列,它們也編碼120和141個(gè)氨基酸的前體蛋白,預(yù)測的分子量分別為13.5kD和15.1kD,兩種動物L(fēng)H序列的同源性達(dá)到95﹪以上.5.與多數(shù)哺乳類動物相似,克隆的東北虎α、FSHβ亞基的開放閱讀框?yàn)?63

4、bp和393bp,編碼120和129個(gè)氨基酸的蛋白,分子量為13.5kD和14.7kD.但LHβ亞基序列具明顯特異性,編碼142個(gè)氨基酸的前體蛋白,在信號肽部分比其它物種多一個(gè)Leu,其預(yù)測分子量為15.1kD.在核苷酸和氨基酸水平,東北虎三個(gè)亞基序列與其它物種相應(yīng)序列也具有較高的同源性(64.7-96.6﹪).6.FSH和LH在畜牧業(yè)生產(chǎn)中被廣泛用于促發(fā)情和排卵,目前已在大熊貓、東北虎等瀕危動物人工繁殖中得到試用,但是效果普遍較差,其

5、原因不甚清楚,可能與所用異源激素的異質(zhì)性有關(guān),使用高同源性激素可能會產(chǎn)生更好的效果.7.克隆和分析了進(jìn)化上較保守,并在生長發(fā)育、生殖和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用的大熊貓GH(AmGH)和GHR(AmGHR)基因.8.以pGEX-4T-1為表達(dá)載體,在大腸桿菌BL21中通過與GST融合的方式高效表達(dá)了大熊貓GH.可溶性分析表明表達(dá)的融合蛋白(GST-AmGH)以不溶的包涵體形式存在,采用0.1M NaOH溶解包涵體,得到的蛋白與谷胱甘肽瓊脂糖