DJ-1-shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)轉(zhuǎn)染的SGC7901胃癌細(xì)胞DJ-1的影響.pdf

1、目的：利用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)，以DJ-1為靶基因，設(shè)計(jì)構(gòu)建DJ-1-shRNA真核表達(dá)載體，進(jìn)行測(cè)序鑒定，通過(guò)轉(zhuǎn)染SGC7901胃癌細(xì)胞，檢測(cè)該表達(dá)質(zhì)粒對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞DJ-1基因表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究DJ-1是否參與胃癌細(xì)胞的侵襲遷移、建立動(dòng)物模型研究胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制奠定前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：利用GeneBank中人DJ-1基因序列(NM_007262)作為分析序列，

2、依據(jù)http://www.ambion.com/techlib/mise/siRNA_finder.html上的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)了靶向D J-1基因的3條候選RNA干擾序列，與shRNA真核表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo構(gòu)建重組質(zhì)粒;同時(shí)設(shè)計(jì)并構(gòu)建陰性對(duì)照RNA干擾重組載體，用于鑒定pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒介導(dǎo)的RNA干擾體系的特異性，并對(duì)重組載體進(jìn)行測(cè)序鑒定。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)大腸桿菌進(jìn)行克隆，將克隆得到的重組質(zhì)粒

3、通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染SGC7901胃癌細(xì)胞，采用RT-PCR，Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞中DJ-1mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Top10大腸桿菌經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選可見(jiàn)有細(xì)菌克隆長(zhǎng)出。經(jīng)測(cè)序分析證實(shí)，靶向DJ-1基因的3個(gè)pGPU6/GFP/Neo-shRNA重組載體及陰性對(duì)照RNA干擾重組載體構(gòu)建成功，分別命名為pGPU6/GFP/Neo-shDJ-1-A，pGPU6/GFP/Neo-shDJ-1-B, pG

4、PU6/GFP/Neo-shDJ-1-C, pGPU6/GFP/Neo-shNC。RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示:pGPU6/GFP/Neo-shDJ-1-C轉(zhuǎn)染組瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后靶基因D J-1表達(dá)的抑制效果最強(qiáng)達(dá)78％以上，第2組陰性對(duì)照重組載體轉(zhuǎn)染后DJ-1基因的表達(dá)無(wú)明顯變化(P＜0.01);Westernblot法檢測(cè)結(jié)果顯示:pGPU6/GFP/Neo-shDJ-1-C轉(zhuǎn)染組瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后靶基因DJ-1表達(dá)的抑制效果最強(qiáng)達(dá)75％以上，第2