野生型及突變型乙型肝炎病毒X基因的克隆、表達、純化及免疫鑒定.pdf

1、研究背景及目的:
　　 乙型肝炎病毒(HBV)感染是影響全球人類健康的重要疾病，HBV慢性感染是形成人類肝細胞癌的主要致病因素。HBV基因組含有4個開放讀碼框架(openreadingframe，ORF)，即S、C、P和X區(qū)。其中，X區(qū)在HBV基因組的第1374-1838位核苷酸，長約465個堿基，是HBV基因組中最小的ORF，其編碼的x蛋白(即乙型肝炎病毒x抗原，HBxAg)與乙型肝炎肝硬化(以下簡稱為乙肝肝硬化，liverc

2、irrhosis，LC)、原發(fā)性肝細胞癌(Primaryhepatocellularcarcinoma，HCC)的發(fā)生具有明顯的相關性。由于HBV復制體系獨特，在慢性感染者免疫壓力等因素作用下，HBV經常發(fā)生突變。研究發(fā)現由HBV導致的HCC患者體內的HBV突變率比無癥狀攜帶者(asymptomaticcarrier,ASC)體內病毒突變率明顯增高，其中最常見的突變類型是A1762T/G1764A雙突變。由于A1762T/G1764A雙

3、突變位于核心啟動子(corepromoter,CP)編碼區(qū)，目前許多學者認為A1762T/G1764A雙突變在一定程度上影響到CP的活性。但是，由于HBV基因組中編碼區(qū)具有高度重疊性，A1762T/G1764A雙突變正好引起了HBxAg第130位和131位氨基酸的改變。這種改變很可能會導致HBV蛋白結構和功能的變化，繼而影響到HBV相關性腫瘤的發(fā)生和疾病的進展。因此，我們構建野生型和A1762T/G1764A雙突變型乙型肝炎病毒X基因原

4、核表達系統(tǒng)，表達并純化2種抗原，即HBxAg-野生及HBxAg-突變，同時制備2種抗原相應的兔抗血清，為深入研究HBVX基因及其雙突變后對HBV慢性感染者病情發(fā)展和腫瘤發(fā)生的作用奠定基礎。
　　 方法:
　　 從慢性乙型肝炎患者血清中抽提HBV基因組DNA，經PCR擴增和基因測序，證實并獲得野生型及A1762T/G1764A雙突變型HBVX基因。應用TA克隆及亞克隆技術將2基因分別插入pGEX-6P-2載體，構建pGEX

5、-6P-2-HBVXw(野生型)及pGEX-6P-2-HBVXm(A1762T/G1764A雙突變型)重組表達載體;轉化入宿主菌進行誘導表達;包涵體復性后，GSTrapFF蛋白純化柱純化帶有GST標簽的野生型和A1762T/G1764A突變型HBVx抗原(HBxAg);應用SDS-PAGE、Westernblot和ELISA方法對表達的野生型和雙突變型HBxAg進行鑒定;分別制備兔抗HBxAg-野生及HBxAg-突變多克隆抗體(HBxA

6、b-野生，HBxAb-突變)，應用ELISA方法對2種抗體分別鑒定;用HiTraprProteinAFF純化柱純化兔HBxAb多克隆抗體。
　　 結果:
　　 1.SDS-PAGE證實本研究構建的2個表達系統(tǒng)均能高效表達目的蛋白;
　　 2.復性、純化后野生型和雙突變型GST-HBxAg濃度分別達到4.88mg/ml和5.07mg/ml;
　　 3.Westernblot鑒定證實所純化的野生型和雙突變型H

7、BxAg均能被同一種特異性的單克隆抗體所識別，提示2種重組抗原具有相似的抗原性;
　　 4.ELISA方法檢測顯示2種抗原都能成功包被于微量滴定板上并與乙肝患者血清反應;
　　 5.ELISA方法證實本研究制備的兔多克隆HBxAb-野生及HBxAb-突變均能特異地識別野生型和雙突變型HBxAg。
　　 結論:
　　 本研究成功地構建了野生型和A1762T/G1764A雙突變型HBVX基因表達系統(tǒng)，成功制備