TeT-On調(diào)控HSV1-tk基因治療系統(tǒng)致MCF-7細(xì)胞DNA損傷及調(diào)亡機制研究.pdf

1、乳腺癌是嚴(yán)重危害女性健康的一種疾病，已經(jīng)逐漸成為當(dāng)今社會一個嚴(yán)峻的衛(wèi)生問題。目前迫切需要開發(fā)新的有效的和毒性低的治療系統(tǒng)來降低乳腺癌死亡率。腫瘤的自殺基因治療具有良好應(yīng)用前景。其中單純皰疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因聯(lián)合GCV的治療系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。
　　在前期研究中，成功利用Tet-On調(diào)控系統(tǒng)對單純皰疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因tk實施了精確調(diào)控。通過彗星實驗檢測到該治療系統(tǒng)處理乳腺癌細(xì)胞株MCF-748 h后有明顯的彗星拖尾現(xiàn)象。我們推測

2、該系統(tǒng)對MCF-7細(xì)胞的殺傷作用可能參與DNA損傷修復(fù)或阻止DNA合成等過程。為了進(jìn)一步揭示Tet-On調(diào)控HSV1-tk治療乳腺癌的分子機制，我們擬運用RT-PCR及Western blotting技術(shù)檢測DNA損傷修復(fù)相關(guān)分子在mRNA、蛋白水平的表達(dá)變化;免疫熒光技術(shù)檢測BRCA1、γ-H2AX在細(xì)胞中的定位;用MTT及集落形成實驗檢測細(xì)胞體外增殖;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡;DAPI染色進(jìn)行細(xì)胞核形態(tài)觀察。結(jié)果顯示:該系統(tǒng)干預(yù)M

3、CF-7后，H2AX在mRNA水平表達(dá)上調(diào);γ-H2AX在蛋白水平表達(dá)上調(diào);免疫熒光組織化學(xué)顯示γ-H2AX定位于細(xì)胞核、BRCA1主要位于細(xì)胞質(zhì);MTT和集落形成實驗顯示MCF-7細(xì)胞的體外增殖能力受到影響;與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的多種分子ATM、P53、BRCA1、PARP1、PNK、R2、TK1、CHK2、RB、P21等表達(dá)量上調(diào);Western blotting檢測到PARP1蛋白的剪切現(xiàn)象，預(yù)示凋亡的產(chǎn)生。進(jìn)一步檢測凋亡現(xiàn)象:流