TET1對乳腺癌MCF-7細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響.pdf

1、第一部分：構(gòu)建低表達(dá)TET1的MCF-7細(xì)胞株
　　目的：乳腺癌近些年來的發(fā)病率逐年升高，其治療形成了以手術(shù)、化療、內(nèi)分泌治療、放療、靶向治療及生物治療為主的綜合治療。然而，乳腺癌的致死率依舊高居女性惡性腫瘤死亡率的第三位。這其中，有超過90％的死亡是由于腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移引起的。因此，探索腫瘤發(fā)生發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移機(jī)制一直是研究熱點(diǎn)。有研究表明，10-11異位蛋白（ten-eleven translocation1，TET1）作為促D

2、NA去甲基化過程中的重要蛋白，可以催化5-甲基胞嘧啶（5mC）轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶（5hmC），實(shí)現(xiàn)DNA去甲基化和基因表達(dá)的調(diào)控。
　　因此，本研究以人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株為模型，通過沉默TET1基因表達(dá)，研究TET1對MCF-7細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以期為腫瘤的臨床診治提供新的靶點(diǎn)。
　　材料與方法：應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染方法，構(gòu)建TET1低表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株（MCF-7-siTET1）以及攜帶eGFP的陰性對照穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株（M

3、CF-7-negative control,MCF-7-NC），運(yùn)用SYBR Green法實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測TET1在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，Western blot法檢測TET1在蛋白水平的表達(dá)。
　　結(jié)果：成功建立低表達(dá)TET1的MCF-7細(xì)胞模型（MCF-7-siTET1），用 SYBR Green法實(shí)時(shí)定量 PCR檢測 TET1的表達(dá)，結(jié)果示，在MCF-7-siTET1中，與 MCF-7-NC組相比，MCF-7-siTET1細(xì)

4、胞中 TET1表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；Western blot法檢測TET1表達(dá)，應(yīng)用 Image J掃描其灰度值，結(jié)果表明，與 MCF-7-NC組相比， MCF-7-siTET1細(xì)胞中TET1表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建沉默TET1的MCF-7-siTET1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株模型。
　　第二部分：TET1對乳腺癌MCF-7細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響
　　目的：10-11異

5、位蛋白（ten-eleven translocation1，TET1）在DNA去甲基化過程中發(fā)揮重要作用，可通過催化5mC轉(zhuǎn)化為5hmC實(shí)現(xiàn)DNA去甲基化和基因表達(dá)的調(diào)控。有研究指出，TET1基因的突變與多種實(shí)體瘤的發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　因此，本研究探究TET1對MCF-7細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的影響，并通過實(shí)驗(yàn)初步探究TET1影響的相關(guān)分子機(jī)制，以期為腫瘤的臨床診治提供新的思路

6、。
　　材料與方法：
　　1.倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞形態(tài)，以MCF7-NC作為陰性對照組，以MCF-7作為空白對照組，運(yùn)用CCK-8法檢測沉默TET1對MCF-7細(xì)胞增殖的影響，利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、TranswellTM檢測TET1對細(xì)胞遷移、侵襲能力的作用，最后應(yīng)用 Western blot檢測 TET1與 EMT相關(guān)蛋白（E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、Vimentin）分子的表達(dá)。

7、>　　2.應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，兩獨(dú)立樣本的比較應(yīng)用成組t檢驗(yàn)分析，多組間均數(shù)的比較應(yīng)用單因素方差分析，多樣本均數(shù)間的多重比較應(yīng)用Tukey檢驗(yàn)分析，數(shù)據(jù)運(yùn)用mean±SD表示，每組實(shí)驗(yàn)不少于3個(gè)獨(dú)立樣本的重復(fù)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖能力， MCF-7組與MCF-7-NC組相比，細(xì)胞增殖未見明顯差異，而MCF-7-siTET1組細(xì)胞增殖能力

8、相較前兩組明顯升高（P<0.001）。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力，MCF-7組與MCF-7-NC組相比，細(xì)胞增殖未見明顯差異，而MCF-7-siRNA組細(xì)胞增殖能力高于MCF-7-NC組和MCF-7組（P<0.0001）。
　　2.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力，與MCF-7組及MCF-7-NC組相比，MCF-7-siTET1組細(xì)胞的遷移能力顯著增強(qiáng)（P<0.01）。
　　3.TranswellTM小室檢測細(xì)胞的侵襲能

9、力，與MCF-7組和MCF-7-NC組相比，MCF-7-siTET1組細(xì)胞的侵襲能力顯著上升（P<0.0001）。
　　4.選用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)， MCF-7-NC組和MCF-7-siTET1組細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，進(jìn)一步運(yùn)用Western blot法檢測EMT相關(guān)標(biāo)志物：與MCF-7組和MCF-7-NC組細(xì)胞相比，MCF-7-siTET1組細(xì)胞的E-cadherin表達(dá)降低（P<0.0001），N-cadherin表達(dá)升高（