載HSV1-TK基因的納米超聲分子探針靶向識(shí)別并殺滅HIFU治療肝癌后殘留病灶的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝癌是一個(gè)全球性健康問(wèn)題，全世界每年因肝癌造成66萬(wàn)2千人死亡，而我國(guó)占一半。肝切除和肝移植被認(rèn)為是治療肝癌最佳方案，然而由于肝癌的早期癥狀和體征不明顯，早期診斷困難，多數(shù)患者臨床就診時(shí)屬于中晚期，已經(jīng)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，大部分不能手術(shù)切除。
　　高強(qiáng)度聚焦超聲(HIFU)是無(wú)創(chuàng)性治療腫瘤的新方法，其機(jī)制主要是應(yīng)用超聲波可聚焦和穿透性，短時(shí)間內(nèi)使靶區(qū)組織溫度達(dá)到65～100℃，使靶組織造成凝固性壞死，HIFU是治療中晚期肝癌安全、有效的方法

2、。但HIFU治療肝癌也存在一些缺陷:a.肝臟腫瘤由于肋骨遮擋，導(dǎo)致治療效率的降低;b中晚期肝癌，血供豐富，熱沉積效率低，聚焦點(diǎn)能量低，療效差;c.由于肝臟隨呼吸運(yùn)動(dòng)，HIFU定位不準(zhǔn)確，可能出現(xiàn)治療盲區(qū)，造成殘癌的存在。由于以上原因，導(dǎo)致HIFU治療肝癌后易復(fù)發(fā)可能，為了解決以上問(wèn)題，可聯(lián)合基因治療，力求徹底殺滅殘余肝癌細(xì)胞，彌補(bǔ)HIFU治療的不足，提高HIFU治療中晚期肝癌的療效。
　　單純皰疹病毒Ⅰ型胸苷激酶/更昔洛韋(HSV

3、1-TK/GCV)自殺基因系統(tǒng)，是眾多腫瘤基因治療效果明顯、應(yīng)用最廣泛、最成熟、最為有效的基因治療方法之一。自殺基因系統(tǒng)的原理:通過(guò)胸甘激酶的表達(dá)，磷酸化前藥更昔洛韋，阻止肝癌細(xì)胞的DNA合成，從而起殺滅肝癌細(xì)胞的作用。自殺基因系統(tǒng)直接殺傷作用及旁觀者效應(yīng)作用顯著。
　　最近出現(xiàn)的一種超聲波靶向爆破攜基因的微泡技術(shù)(UTMD)，即當(dāng)攜基因的微泡造影劑經(jīng)靜脈注射進(jìn)入腫瘤組織時(shí)，經(jīng)超聲聲像圖確定其到達(dá)靶組織后，通過(guò)低頻超聲波擊碎攜基因

4、的微泡造影劑，產(chǎn)生的空化效應(yīng)及機(jī)械效應(yīng)，使外源性基因進(jìn)入腫瘤組織，在低頻的超聲輻照條件下，超聲既可提高靶基因的轉(zhuǎn)染率，又不破壞轉(zhuǎn)染基因，實(shí)現(xiàn)基因治療的靶向性和準(zhǔn)確性。
　　前期試驗(yàn)在國(guó)家自然科學(xué)基金的資助下（高強(qiáng)度聚焦超聲聯(lián)合超聲微泡包裹HSV-TK自殺基因靶向治療肝癌的實(shí)驗(yàn)研究NO.30872977)，我們證明了在小鼠移植瘤模型中，通過(guò)超聲波靶向爆破攜自殺基因的微泡釋放，明顯增加自殺基因轉(zhuǎn)染率及靶向性。
　　但我們的課題仍

5、有些不足之處:a.由于脂質(zhì)微泡不能通過(guò)血管內(nèi)皮間隙，因而脂質(zhì)微泡并未真正意義上進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，僅在腫瘤血管周圍聚集，降低了治療效果;b.攜基因的微泡在基因治療中無(wú)主動(dòng)靶向性，僅有相對(duì)靶向性，其原理為:脂質(zhì)微泡通過(guò)腫瘤區(qū)動(dòng)脈壓與周圍動(dòng)脈壓壓力差，隨血液聚集到腫瘤區(qū)域，因此僅具有相對(duì)靶向性，不能主動(dòng)識(shí)別腫瘤組織。以上缺點(diǎn)導(dǎo)致基因治療效果不佳，如何提高基因治療的主動(dòng)靶向性，是基因治療的熱點(diǎn)問(wèn)題。
　　超聲分子探針即靶向超聲微泡（球）造影劑

6、，是將能與靶組織上相應(yīng)的受體結(jié)合的特異性配體耦聯(lián)到微泡表面，使其能主動(dòng)識(shí)別靶組織，達(dá)到分子水平的特異性增強(qiáng)顯影。
　　隨著分子生物學(xué)與納米技術(shù)發(fā)展，納米級(jí)造影劑以其穿透力強(qiáng)、分子小的突出特性，有望彌補(bǔ)脂質(zhì)微泡不能通過(guò)血管內(nèi)皮間隙的不足，成為基因的新型載體。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)，是存在于肝細(xì)胞性肝癌細(xì)胞膜表面的硫酸乙酰肝素多糖蛋白(HSPC)，參與腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移。AFP定位于肝細(xì)胞胞漿中，在循環(huán)中可

7、被抗體中和，不適合為抗體識(shí)別位點(diǎn)，GPC3是存在于細(xì)胞膜表面，可成為抗體識(shí)別部位。因此，我們選用GPC3單抗與納米級(jí)超聲造影劑結(jié)合，構(gòu)建具有主動(dòng)靶向性的納米級(jí)超聲分子探針，有望解決基因治療時(shí)低轉(zhuǎn)染率、靶向性差等諸多問(wèn)題。
　　本項(xiàng)目旨在主動(dòng)投遞靶向造影劑即超聲分子探針于殘癌組織內(nèi)并在殘留肝癌組織中特異性表達(dá)，利用超聲分子主動(dòng)靶向識(shí)別殘癌組織，進(jìn)而使自殺基因利用直接殺傷和旁殺作用殺滅殘癌組織，力圖在HIFU和聯(lián)合基因靶向治療肝癌方面

8、取得新的進(jìn)展。
　　本課題研究?jī)?nèi)容主要包括以下三個(gè)部分:
　　第一部分載HSV-TK自殺基因的肝癌特異性納米級(jí)超聲分子探針合成
　　目的:制備載HSV1-TK自殺基因的肝癌特異性納米級(jí)超聲分子探針.
　　方法:生物素-親和素構(gòu)建GPC3單抗與納米級(jí)超聲造影劑結(jié)合，應(yīng)用超聲圖像定量分析儀(DFY軟件分析系統(tǒng))分析超聲圖像的視頻強(qiáng)度改變，并描繪時(shí)間一峰值曲線，Zeta電位儀測(cè)試分析出載HSV1-TK自殺基因的肝癌特異

9、性納米級(jí)超聲分子探針平均粒徑、電位、濃度。
　　結(jié)果:超聲聲像圖可見，注入超聲分子探針（主動(dòng)靶向造影劑）造影劑呈向心性強(qiáng)化逐漸聚集到腫瘤中心，直至腫瘤全部強(qiáng)化，與普通造影劑比較，超聲分子探針造影峰值((VI))更高，聲強(qiáng)更強(qiáng)，達(dá)峰時(shí)間縮短，持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。Zeta電位儀測(cè)試分析出載HSV-TK自殺基因的肝癌特異性納米級(jí)超聲分子探針，其平均粒徑、電位、濃度符合納米級(jí)超聲分子探針要求。
　　結(jié)論:成功制備載HSV1-TK自殺基因的

10、肝癌特異性納米級(jí)超聲分子探針，能夠在裸鼠殘癌模型中增強(qiáng)顯像，是一種理想的超聲分子探針。
　　第二部分低頻超聲輻照載HSV1-TK基因的納米超聲分子探針靶向治療HIFU消融后裸鼠殘留肝癌實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:觀察低頻超聲輻照載HSV1-TK基因納米超聲分子探針在HIFU消融后裸鼠殘留肝癌組織中的表達(dá)情況及結(jié)合前藥更昔洛韋(GCV)對(duì)HIFU消融后裸鼠殘留肝癌的殺傷效果。
　　方法:取荷瘤裸鼠肝癌60只，HIFU治療儀（重慶

11、海扶技術(shù)有限公司研制）對(duì)裸鼠肝癌消融80％后，成功建立裸鼠殘留肝癌模型。隨即分成六組，每組10只，A組:HIFU聯(lián)合超聲輻照載基因納米級(jí)超聲分子探針組（主動(dòng)靶向組）（HIFU+US+HSV1-T K+NB+G PC3）;B組: HIFU聯(lián)合超聲輻照基因納泡組（被動(dòng)靶向組）(HIFU+US+HSV1-TK+NB):C組:HIFU聯(lián)合載基因超聲分子探針組(HIFU+HSV1-TK+NB+GPC3);D組:HIFU聯(lián)合超聲輻照基因組(HIFU

12、+US+HSV1-TK);E組:HIFU聯(lián)合超聲輻照超聲分子探針組(HIFU+US+NB+GPC3);F組:HIFU治療組（空白對(duì)照組）。分別經(jīng)殘癌裸鼠尾靜脈注入相同濃度的: HSV1-TK+NB+GPC3，HSV1-TK+NB, HSV1-TK+NB+GPC3, HSV1-TK, GPC3, PBS,A、B、D、E組分別給予超聲輻照，Real-time PCR檢測(cè)TK mRNA表達(dá)情況，Western-blot及免疫組化檢測(cè)TK蛋白的

13、表達(dá)情況，用TUNEL法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡情況，繪制抑瘤曲線。
　　結(jié)果:免疫組化及Real-time PCR及Western-blot及調(diào)亡指數(shù)及抑瘤率均顯示A組（主動(dòng)靶向組）TK的表達(dá)量明顯高于被動(dòng)靶向組和其他各組(P＜0.05)，且能明顯改善殘癌裸鼠的生存時(shí)間。
　　結(jié)論:低頻超聲輻照載HSV1-TK基因的納米超聲分子探針，主動(dòng)靶向投遞HSV1-TK自殺基因于殘癌組織內(nèi)并在殘留肝癌組織中特異性表達(dá)，提高HSV1-TK自殺

14、基因的轉(zhuǎn)染效率，增強(qiáng)了自殺基因?qū)β闶髿埌┑臍Ч?br>　　第三部分:不同濃度載HSV1-TK基因的納米超聲分子探針靶向造影劑對(duì)HIFU治療后裸鼠殘留肝癌的影響
　　目的:研究高強(qiáng)度聚焦超聲(HIFU)治療裸鼠殘留肝癌后，觀察不同濃度載HSV1-TK基因納米超聲分子探針靶向造影劑對(duì)裸鼠殘留肝癌組織中TK基因表達(dá)的影響。
　　方法:建立裸鼠肝癌模型50只，隨即分成五組，每組10只，使用HIFU治療儀對(duì)裸鼠消融80％后，經(jīng)裸

15、鼠尾靜脈注入不同濃度載納米超聲分子探針靶向造影劑，然后用超聲輻照。免疫組化及Western-blot檢測(cè)TK蛋白的表達(dá)情況，Real-time PCR檢測(cè)TK mRNA表達(dá)情況，用TUNEL法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡情況，繪制抑瘤曲線。
　　結(jié)果:免疫組化及Real-time PCR及Western-blot及抑瘤率及調(diào)亡指數(shù)均顯示與A組相比，B、C、D、E組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而C、D、E組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。<