攜HSV-TK基因的納米靶向陽離子脂質微泡增效治療HIFU不全消融后殘余肝癌的實驗研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，在我國肝癌的發(fā)病及致死率位居全球之首。目前肝癌的治療方式有多種選擇，手術切除仍是早期肝癌的主要治療方式，但術后存在較高的復發(fā)率，且多數患者就診時已為中晚期或終末期，喪失手術機會。目前我國對喪失手術機會的中晚期肝癌的治療以射頻治療及經肝動脈介入栓塞化療為主要方式，但其存在較多嚴重并發(fā)癥且給患者帶來較大痛苦。近年來，隨著科學技術不斷發(fā)展，高強度聚焦超聲（HIFU）作為新的治療手段已被廣泛應用于臨床，在眾多腫

2、瘤或非腫瘤性疾病的治療中取得較好的效果。HIFU治療的原理主要是通過超聲波的熱效應來殺滅病灶，但在臨床治療腫瘤時，由于腫瘤大多位于深部組織或器官，超聲波穿透組織時不可避免的產生聲能衰減，同時腫瘤區(qū)域的血供豐富，能量會隨血液快速流動而衰減，這些因素都限制了HIFU治療的徹底性，降低了HIFU療效，從而導致了腫瘤組織不能完全被殺滅，增加了腫瘤復發(fā)的風險。相關研究表明腫瘤一旦復發(fā)，其侵襲能力較原發(fā)時明顯增加。因此如何提高HIFU治療效果，降低

3、腫瘤的殘留或復發(fā)成為目前研究熱點。隨著研究的進展，腫瘤的發(fā)生及進展與基因突變或缺失相關，因此基因治療被廣大學者認為是最具潛力的治療方式。自殺基因治療是目前腫瘤基因治療中最有成效的方案之一，HSV-TK/GCV系統(tǒng)是自殺基因的一種，HSV-TK本身不具備殺傷功能，其轉染進入細胞后可將無毒的GCV轉化成細胞毒性物質進行殺傷。但如何將HSV-TK高效、安全、無創(chuàng)、無毒的轉染進入組織細胞成為限制其發(fā)展的瓶頸。
　　近年來，靶向超聲微泡被廣

4、泛應用于基因的攜載，載基因微泡注入體內后通過其表面靶向性配體、抗體與腫瘤組織受體特異性結合，從而在靶區(qū)域聚集，利用一定強度超聲體表輻照使微泡破裂，從而釋放攜帶目的基因，同時微泡破裂產生的空化效應及聲孔效應，可促進細胞膜通透性增加，促進基因轉染。
　　因此，在本實驗中，我們制備了納米級陽離子微泡，并將肝癌特異性表達的GPC3抗體進行連接構建靶向陽離子微泡，然后再將HSV-TK質粒與靶向陽離子微泡連接，構建納米攜基因靶向陽離子微泡并檢

5、測其物理性能，通過體內、體外實驗，探討其靶向能力及HSV-TK/GCV系統(tǒng)對腫瘤的治療作用。本課題包括以下三部分：
　　第一部分.攜基因靶向超聲微泡的制備
　　第一節(jié):納米微泡的制備及鑒定
　　目的:構建不同類型超聲微泡用于攜帶目的基因。
　　方法:通過機械震蕩法來構建不同的脂質微泡，其中陽離子微泡在成膜材料中加入DC-膽固醇（DC-cholesterol）使微泡表面帶正電荷，以此來構建陽離子微泡（CMB），在光

6、鏡下觀察各種微泡的基本形態(tài)及均一性，檢測各種微泡的表面電位和粒徑。
　　結果:各種微泡構建成功，光鏡下觀察兩種微泡分布均勻，粒徑大小均一，普通微泡表面電荷為-2.38±0.56mV，呈微弱負電荷，陽離子微泡的表面電位為26.44±2.13mV，普通微泡的粒徑為512.57±25.18nm，陽離子微泡的粒徑為502.63±21.26nm。
　　結論:兩種微泡間相互比較，電位具有顯著性差異（p＜0.01），粒徑間比較，差異無統(tǒng)計

7、學意義（p＞0.05）。
　　第二節(jié):靶向微泡的構建及其性能檢測
　　目的:將GPC3抗體及HSV-TK質粒與微泡連接，構建攜基因靶向微泡。
　　方法:將制備好的陽離子微泡通過“生物素-親和素”法與靶向抗體GPC3單抗進行連接，同時將陽離子微泡與同型對照抗體連接；構建成功的普通微泡、陽離子微泡、靶向陽離子微泡（5×108個）與質粒（HSV-TK）共孵育，利用靜電吸附原理使二者充分結合，然后進行洗滌、離心，通過對未結合的

8、質粒的量進行測定來檢測不同類型微泡攜帶質粒能力，激光共聚焦顯微鏡檢測質粒及抗體與微泡的連接情況。
　　結果:普通攜基因微泡、陽離子攜基因微泡、靶向陽離子攜基因微泡及陽離子對照抗體微泡成功構建，激光共聚焦下連接成功的微泡大小均一，分散度較好，激光共聚焦顯微鏡下GPC3抗體與微泡連接后呈現綠色熒光，HSV-TK質粒與微泡連接后呈現紅色熒光，二者原位重疊后呈現黃色熒光，表明成功構建靶向攜基因微泡。普通微泡、陽離子微泡和陽離子靶向微泡攜帶

9、HSV-TK質粒的能力分別為0.36±0.03μg，17.91±1.15μg和17.26±2.01μg，兩組陽離子微泡之間攜帶質粒的能力無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），陽離子微泡與普通微泡之間比較，差異具有顯著性（p＜0.01）。
　　結論:通過“生物素-親和素”系統(tǒng)可以將納米微泡、HSV-TK質粒及GPC3抗體成功連接，成功構建了納米級靶向攜基因微泡；陽離子微泡攜基因能力明顯大于普通微泡，陽離子微泡連接抗體后并不影響其攜載能力。<

10、br>　　第二部分.攜HSV-TK基因的不同類型微泡尋靶和在超聲作用下轉染HEPG-2細胞的實驗研究
　　第一節(jié):攜基因靶向微泡的體外、體內尋靶能力檢測
　　目的:檢測普通微泡、陽離子微泡及靶向陽離子微泡體外、體內靶向尋找HepG-2細胞的能力。
　　方法:
　?。?）利用免疫組化法證實HepG-2細胞膜存在GPC3抗原表達；
　　（2）利用自行設計的玻板進行HepG-2細胞培養(yǎng)，使細胞貼壁，然后將細胞已貼

11、壁的玻板翻轉并與微泡充分孵育后，再將玻板翻轉，倒置顯微鏡下觀察HepG-2細胞與微泡結合數，檢測不同類型微泡的體外尋靶能力；
　?。?）裸鼠皮下注射肝癌HepG-2細胞，建立裸鼠肝癌種植瘤模型,免疫組化法證實GPC3表達于腫瘤細胞表面。不同類型微泡經裸鼠尾靜脈注射，通過超聲腫瘤成像，檢測其體內靶向腫瘤細胞能力。兩部分實驗中，對照抗體陽離子微泡作為陽離子靶向微泡的對照而納入實驗分組中，競爭抑制實驗被用于證實靶向陽離子微泡與靶細胞的特

12、異性結合。
　　結果:
　　（1）免疫組化法證實HepG-2細胞表面存在GPC3抗原表達；
　　（2）尋靶試驗，除普通微泡外，陽離子微泡、靶向陽離子微泡、陽離子對照抗體微泡均可與表達GPC3抗原的HepG-2細胞結合，而陽離子靶向微泡與HepG-2細胞靶向結合數量最高（P＜0.01）；率先加入GPC3抗體孵育后，靶向陽離子微泡與HepG-2細胞結合數量明顯降低（P＜0.01）；而細胞與同型對照抗體共孵育后，靶向陽離子微

13、泡與HepG-2細胞結合數量沒有明顯影響（P＞0.05）；
　?。?）體內試驗中，超聲證實：除靶向陽離子微泡外，普通微泡、陽離子微泡及陽離子對照抗體微泡均不能靶向結合表達GPC3抗體的腫瘤細胞；在超聲顯像的造影模式和傳統(tǒng)灰階模式下，與對照組相比，經普通微泡、陽離子微泡與靶向陽離子微泡注射后，種植瘤內均可見回聲增強；且陽離子微泡組與靶向陽離子微泡組比普通微泡組回聲更強，其中靶向陽離子微泡組回聲最強。體內競爭抑制實驗：通過裸鼠尾靜脈注

14、射GPC3抗體后，靶向陽離子微泡與腫瘤細胞靶向結合數量顯著降低（P＜0.001）。
　　結論:
　?。?）陽離子微泡、靶向陽離子微泡及陽離子對照抗體微泡均可與表達GPC3抗原的HepG-2細胞結合，但只有靶向陽離子微泡能與HepG-2細胞靶向結合，而陽離子微泡及陽離子對照抗體微泡與HepG-2細胞結合是非特異性結合，這種結合方式的優(yōu)勢在體內實驗中不復存在；
　　（2）超聲顯像也證實靶向陽離子微泡體內較好的尋靶效果，充分

15、證實了靶向陽離子微泡體內、體外均具有較好的靶向能力。
　　第二節(jié):超聲作用下攜HSV-TK基因的不同類型微泡轉染HepG-2細胞的實驗研究
　　目的:探討在超聲作用下普通微泡、陽離子微泡及靶向陽離子微泡轉染HepG-2細胞的轉染效率，以及轉染后HSV-TK/GCV對細胞增殖抑制、腫瘤細胞侵襲的影響。
　　方法:實驗分空白對照組、普通微泡組、陽離子微泡組、靶向陽離子組四組，將不同類型微泡連接HSV-TK質粒后，超聲（1M

16、Hz,1W/cm2, and50％duty cycle(DC),30seconds）作用下轉染HepG-2細胞，轉染后檢測轉染效率，MTT檢測細胞增殖抑制率，qPCR及Western分別檢測TK、VEGF、Caspase-3 mRNA及蛋白表達情況；通過體外HepG-2細胞侵襲實驗評價細胞的侵襲能力。
　　結果:
　?。?）轉染24小時后各組的轉染效率分別為0.31±0.05%，2.67±0.27%，21.38±2.04%，

17、34.39±2.93%，各組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；
　?。?）轉染后24小時行 MTT檢測細胞增殖抑制率，分別為8.25±0.93%，10.01±0.85%，42.36±3.87%，58.17±5.08%，靶向陽離子微泡組細胞增殖活性降低，組間比較差異亦具統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；
　?。?）qPCR和Western檢測：在陽離子微泡和靶向陽離子微泡組，TK和Caspase-3 mRNA及蛋白表達增加，而V

18、EGF mRNA及蛋白表達下降，兩組間比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；
　?。?）在腫瘤細胞侵襲實驗中，各組遷移腫瘤細胞數目分別為：61.25±4.29、66.53±5.25、63.86±4.98、34.59±2.94、24.91±2.25，各組間比較差異具有顯著性（P＜0.01）。
　　結論:陽離子微泡及靶向陽離子微泡組與對照組及普通微泡組比較，轉染效率明顯增高，其中靶向陽離子微泡組具有更高的轉染率及其相應的生物學

19、效應，可以明顯抑制腫瘤細胞增殖及腫瘤細胞的侵襲。
　　第三部分.超聲作用下攜HSV-TK基因的不同類型微泡轉染治療HIFU不全消融后殘余肝癌的實驗研究
　　目的:探討普通微泡、陽離子微泡及靶向陽離子微泡攜HSV-TK質粒在超聲作用下轉染治療HIFU不全消融HepG-2種植瘤效果，觀察各組微泡對殘癌組織生長的影響及治療作用。
　　方法:
　?。?）裸鼠左后肢皮下注射HepG-2細胞懸液建立種植瘤模型，造模后14天，

20、裸鼠種植瘤模型建立成功，給予HIFU治療，進行不全性消融，建立殘癌模型；
　?。?）隨機分為4組，分別為對照組（經尾靜脈注射生理鹽水）、普通微泡組（經尾靜脈注射普通微泡）、陽離子微泡組（經尾靜脈注射陽離子微泡）及靶向陽離子微泡組（經尾靜脈注射靶向陽離子微泡），每組微泡均已與HSV-TK質粒連接；
　　（3）轉染后行活體成像掃描，并應用圖像分析軟件評價尋靶效果；
　?。?）尋靶成功后，普通微泡、陽離子微泡及靶向陽離子微泡

21、各組在超聲（1MHz,2W/cm2, and50%DC,30seconds）作用下轉染腫瘤細胞，轉染后予以GCV腹腔注射；
　?。?）用免疫組化法檢測腫瘤組織中TK、PCNA、CD31及VEGF的表達；并通過CD31的表達計算腫瘤細胞微血管形成情況，q-PCR檢測TK、VEGF和caspase3mRNA表達；TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡；記錄荷瘤裸鼠生存時間。
　　結果:
　?。?）HE染色證實癌細胞殘留，HIFU不全

22、消融模型成功構建，微泡注入后行活體成像見殘癌組織出現綠色熒光，HSV-TK質粒被成功轉染進入組織細胞；
　?。?）免疫組化及q-PCR結果顯示除對照組外，各組均有TK蛋白表達，且陽離子靶向微泡組表達水平最高，再次證實HSV-TK基因成功轉染進入腫瘤細胞內；
　?。?）免疫組化及TUNEL結果顯示靶向陽離子微泡組腫瘤增殖明顯受到抑制（P<0.01）、凋亡指數明顯增高（P<0.01），血管生成受到明顯抑制（P<0.05），生存時