酪氨酸酶基因轉(zhuǎn)染MSC移植后在體MRI顯像示蹤.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BM-MSC)是存在于骨髓質(zhì)中除HSCs之外的另一類具有自我復(fù)制、更新能力和多向分化潛能的非造血組織干細(xì)胞。在一定的體內(nèi)和體外誘導(dǎo)條件下，可以分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)MSC具有易于分離培養(yǎng)、低免疫原性、易于外源基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá)的特性，而且MSCs能夠加速HSCs歸巢和植入，多

2、方面促進(jìn)造血，下調(diào)異基因免疫反應(yīng)等特點(diǎn)，使MSCs與HSCs共移植治療惡性血液病成為熱點(diǎn)，并廣泛應(yīng)用于組織工程、基因治療等其它領(lǐng)域。
　　 外源性MSCs輸注輔助HSCT已證實(shí)具有良好促進(jìn)造血的效果且無明顯的毒副反應(yīng)；關(guān)于MSCs移植后在體內(nèi)的分布特點(diǎn)和生物學(xué)行為尚無一致結(jié)論，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究中發(fā)現(xiàn)MSCs歸巢骨髓有所不同，在多數(shù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中從骨髓可以檢測到供體源性MSCs，而人體的臨床研究卻證實(shí)成功植入的患者骨髓中MSCs

3、仍為受體源性，可能跟動(dòng)物和人體的檢測方法不同有關(guān)，大多數(shù)動(dòng)物的示蹤方法不能應(yīng)用于人體。因此，了解MSC移植后體內(nèi)的分布特點(diǎn)和生物學(xué)行為，有助于闡明MSC輔助重建造血的機(jī)制。
　　 目前MSC示蹤的方法很多不能運(yùn)用于人體，因此尋找安全、無毒副作用且適用于人體，可長期、在體追蹤BM-MSC自身歸巢和定植的方法，將為探索BM-MSC輔助造血重建的機(jī)制提供一個(gè)良好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。本實(shí)驗(yàn)將酪氨酸酶基因體外轉(zhuǎn)染MSC，輸注體內(nèi)后以MRI技術(shù)在體

4、顯像，以期得到清晰的MSC定植的解剖生理圖像，為可以直觀、無創(chuàng)性地長期在體示蹤MSC的歸巢和定植打下基礎(chǔ)。
　　 本文擬進(jìn)行以下四部分研究：
　　 第一章、小鼠MSC的分離、培養(yǎng)和鑒定。
　　 目的：從小鼠骨髓中分離培養(yǎng)、擴(kuò)增和純化MSC，研究其表面標(biāo)記及分泌的細(xì)胞因子水平等生物學(xué)特點(diǎn)，建立穩(wěn)定、高效的體外培養(yǎng)體系，為下一步MSC的轉(zhuǎn)染和移植提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.MSC的分離培養(yǎng)

5、、擴(kuò)增和純化。全骨髓貼壁法(自然貼壁法)從小鼠骨髓分離單個(gè)核細(xì)胞，以2×106/cm2密度接種在25cm2培養(yǎng)瓶中，37℃，5％CO2飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)，每3～4天換液，原代培養(yǎng)至細(xì)胞接近80％融合時(shí)(7～10天)用0.25％胰酶消化，進(jìn)行傳代、擴(kuò)增培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡逐日觀察細(xì)胞形態(tài)、貼壁情況及生長情況。
　　 2.MSC表面標(biāo)記的檢測。取生長狀態(tài)良好的P3～P5代BM-MSC，用流式細(xì)胞儀檢測BM-MSC免疫表型CD29、C

6、D44、CD105、CD166、CD34、CD45、CD106及CD54的表達(dá)。
　　 3.BM-MSC分泌的細(xì)胞因子的檢測。ELISA法檢測BM-MSC上清中小鼠干細(xì)胞(SCF)、小鼠基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)、小鼠白介素6(IL-6)的水平。
　　 結(jié)論：
　　 1.在適宜的體外培養(yǎng)條件下，可從小鼠骨髓中成功分離MSC，并且純化和大量擴(kuò)增。
　　 2.培養(yǎng)的MSC形態(tài)、免疫表型、分泌的細(xì)胞因子

7、均符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。
　　 第二章、酪氨酸酶基因質(zhì)粒的提純及MSC轉(zhuǎn)染。
　　 目的：純化含酪氨酸酶基因完全cDNA的pcDNA3tyr質(zhì)粒，用脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)染到MSC，為下一步MSC輸注體內(nèi)后實(shí)現(xiàn)MRI在體顯像示蹤提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.pcDNA3tyr質(zhì)粒的純化。采用CaC12轉(zhuǎn)化法法將pcDNA3tyr質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌DH5α菌株，從瓊脂平板上挑取含有外源基因質(zhì)粒的大腸桿菌D

8、H5α單菌落，然后接種于2個(gè)30mlLB培養(yǎng)基的錐形瓶里，37℃250rpm振蕩過夜。按照QIAGENPlasmidMidi試劑盒說明純化pcDNA3tyr質(zhì)粒。
　　 2.pcDNA3tyr質(zhì)粒的鑒定。pcDNA3tyr質(zhì)粒經(jīng)Xba 1、EcoRⅠ雙酶切，隨后經(jīng)瓊脂糖電泳，電泳完畢后，取出凝膠，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。
　　 3.pcDNA3tyr質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MSC轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，接種于24孔板中，以脂質(zhì)

9、體法按照LipofectamineTM 2000試劑盒說明每孔轉(zhuǎn)染0.8μg pcDNA3tyr質(zhì)粒。
　　 4.轉(zhuǎn)染前后MSC的鑒定。
　　 4.1 轉(zhuǎn)染前后MSC的形態(tài)學(xué)觀察。
　　 4.2 轉(zhuǎn)染前后MSC的表面標(biāo)記。用流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染前后MSC免疫表型CD29、CD44、CD105、CD166、CD34、CD45、CD106及CD54的表達(dá)。
　　 4.3 轉(zhuǎn)染前后BM-MSC細(xì)胞因子的分泌。

10、r>　　 5.MSC內(nèi)酪氨酸酶基因的鑒定。
　　 (1)提取總RNA后行RT-PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，與DNA分子量marker進(jìn)行比較。
　　 (2)用RT-PCR法分別在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、7天檢測TYR基因的mRNA的表達(dá)量。方法同前2.4.3。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。本實(shí)驗(yàn)計(jì)量資料以X±SD表示，采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包處理，各實(shí)驗(yàn)組間比較用LSD-t檢驗(yàn)兩兩組間比

11、較。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.脂質(zhì)體法能夠成功將pcDNA3tyr質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MSC，并且證實(shí)是穩(wěn)定和可靠的。
　　 2.轉(zhuǎn)染后的MSC形態(tài)、免疫表型、分泌的細(xì)胞因子均符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特征，轉(zhuǎn)染前后MSC的生物學(xué)特性無改變。
　　 第三章、酪氨酸酶基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MSC體外細(xì)胞及小鼠體內(nèi)黑色素染色。
　　 目的：含酪氨酸酶基因完cDNA的pcDNA3tyr質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MSC后

12、，采用Fontana硝酸銀還原染色法檢測體外細(xì)胞及體內(nèi)組織的黑色素，為下一步酪氨酸酶基因轉(zhuǎn)染MSC后MRI在體顯像示蹤奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.小鼠MSC的分離培養(yǎng)、擴(kuò)增和純化方法同第一章。
　　 2.pcDNA3tyr質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MSC以脂質(zhì)體法按照LipofectamineTM 2000試劑盒說明轉(zhuǎn)染。
　　 3.細(xì)胞黑色素染色。轉(zhuǎn)染后BM-MSC培養(yǎng)24h后行Fontana硝酸銀還原染色法進(jìn)行

13、染色。電鏡、光鏡下觀察黑色素分布
　　 4.組織黑色素染色。
　　 4.1 實(shí)驗(yàn)分組。
　　 4.2 細(xì)胞輸注。
　　 4.3 小鼠存活狀況觀察。
　　 4.4 組織黑色素染色。
　　 結(jié)論：
　　 1.pcDNA3tyr質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MSC，可以在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生黑色素。
　　 2.轉(zhuǎn)染后MSC輸注小鼠，可以在組織內(nèi)檢測黑色素。
　　 3.移植后小鼠7天內(nèi)生長狀況良好，顯示轉(zhuǎn)

14、染pcDNA3tyr質(zhì)粒的BM-MSC輸注無明顯的毒副作用。
　　 第四章、酪氨酸酶基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MSC后體外細(xì)胞及小鼠體內(nèi)MRI顯像。
　　 目的：將酪氨酸酶基因體外轉(zhuǎn)染MSC，輸注體內(nèi)后以MRI技術(shù)在體顯像，可以直觀、無創(chuàng)性地長期在體示蹤-MSC的歸巢和定植，得到清晰的MSC定植的解剖生理圖像，為探索MSC輔助造血的機(jī)制提供良好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。
　　 方法：
　　 1.小鼠MSC的分離培養(yǎng)、擴(kuò)增和純化方法同

15、第一章。
　　 2.體外細(xì)胞MRI顯像。
　　 2.1 pcDNA3tyr質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MSC分別取10μg空白pcDNA3質(zhì)粒、5μg、10μg、20μgpcDNA3tyr質(zhì)粒以脂質(zhì)體法按照LipofectamineTM 2000試劑盒說明轉(zhuǎn)染BM-MSC。
　　 2.2 MSC MRI顯像胰酶消化后獲取細(xì)胞懸液(各約106個(gè)細(xì)胞)，1500r/min離心5min使之沉淀于離心管底，仔細(xì)吸除上清后將1-4號(hào)離心管平行

16、放置，分別代表空白對照及含5μg、10μg、20μgpcDNA3tyr質(zhì)粒的細(xì)胞團(tuán)。并行T1WI、T1WI/SPIR、T2WI序列檢查。
　　 3.小鼠MRI顯像。
　　 3.1 pcDNA3tyr質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MSC。
　　 3.2 轉(zhuǎn)染后MSC移植小鼠。
　　 (1)實(shí)驗(yàn)分組。
　　 (2)細(xì)胞輸注。
　　 (3)實(shí)驗(yàn)小鼠存活狀況觀察每日觀察小鼠活動(dòng)力、外表、飲食、大便、體重等，記錄每組死亡

17、率。
　　 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。單因素方差分析各種細(xì)胞在T1WⅠ、T2WⅠ、STIR掃描序列的信號(hào)強(qiáng)度總體間的差異，以最小有意義差異(least significance difference，LSD)-t檢驗(yàn)觀察上述3個(gè)掃描序列中各細(xì)胞間的信號(hào)強(qiáng)度兩兩間差異是否具有顯著性。P＜0.05表示差異具有顯著性。
　　 結(jié)論：
　　 1.pcDNA3tyr質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

18、MSC后，生成的黑色素可經(jīng)MRI顯像。
　　 2.pcDNA3tyr質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MSC并輸注小鼠體內(nèi)，經(jīng)MRI發(fā)現(xiàn)肝臟黑色素顯影成功，提示活體示蹤的可行性。
　　 全文結(jié)論：
　　 1、成功建立了MSC體外分離培養(yǎng)和擴(kuò)增體系。
　　 2、脂質(zhì)體法能夠成功將pcDNA3tyr質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MSC，轉(zhuǎn)染前后MSC的生物學(xué)特性不受影響。
　　 3、移植后小鼠7天內(nèi)生長狀況良好，顯示轉(zhuǎn)染pcDNA3tyr質(zhì)粒的MS