腺病毒介導(dǎo)的LIGHT對小鼠B淋巴瘤的抗腫瘤作用研究.pdf

1、惡性淋巴瘤(malignant:lymphoma,ML)是原發(fā)于淋巴結(jié)或淋巴結(jié)外組織或器官的一種惡性腫瘤,來源于淋巴細(xì)胞或組織細(xì)胞的惡變.根據(jù)臨床和病理特點(diǎn)不同,ML分為兩個大類,即霍奇金病(Hodkin disease,HD)和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL,),其中B細(xì)胞來源的淋巴瘤是B細(xì)胞淋巴瘤.在臨床上,目前對B細(xì)胞淋巴瘤的治療方法主要是放療化療.盡管放療化療對B淋巴瘤療效較好,但對數(shù)月或數(shù)年之

2、后的復(fù)發(fā)幾乎沒什么療效.大劑量的放療化療雖然可以長期消除腫瘤,但由于其毒性較高卻造成了更高更早的死亡率,因此出現(xiàn)了一些新的治療方法.隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)的飛速發(fā)展,腫瘤生物治療學(xué)也得到了飛速發(fā)展.B淋巴瘤新的治療方法,有重組人α干擾素,CD20、CD19、CD22的靶向性單克隆抗體及抗腫瘤疫苗等.B細(xì)胞淋巴瘤表面抗原的存在,使得淋巴瘤的免疫靶向治療得以實(shí)現(xiàn). B淋巴瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的一個重要原因是缺少活化T細(xì)胞的共刺激分子.

3、近年來的研究著重于改變B淋巴瘤的表型從而使T細(xì)胞更好地識別它們,其中一個途徑是B淋巴瘤的基因修飾,研究較多的是轉(zhuǎn)入CD40L分子的基因.Briones J等用腺病毒介導(dǎo)的CD40L轉(zhuǎn)染B淋巴瘤細(xì)胞,滅活該瘤細(xì)胞作為B細(xì)胞淋巴瘤的疫苗,得到很好的預(yù)防腫瘤的效果.研究發(fā)現(xiàn),CD40L可提高B細(xì)胞做為抗原提呈細(xì)胞(APC)的能力,可以上調(diào)細(xì)胞表面共刺激分子(CD80、CD86、ICAM-1、LFA-3)的表達(dá),它們在T細(xì)胞活化中起重要作用.L

4、IGHT是近年來發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子超家族成員,與CD40L同屬于一個家族,因此可能具有與CD40L類似的作用.已有研究發(fā)現(xiàn)LIGHT可誘導(dǎo)人B細(xì)胞白血病細(xì)胞一些表面刺激分子的表達(dá),從而提高其抗原提呈能力. 本文的主要目的是研究腺病毒介導(dǎo)的L,IGHT對B細(xì)胞淋巴瘤的抗腫瘤作用及免疫機(jī)理,觀察瘤內(nèi)注射LIGHT腺病毒對小鼠A20淋巴瘤模型的治療作用以及轉(zhuǎn)染LIGHT的A20細(xì)胞制備的疫苗對腫瘤的免疫保護(hù)作用.BALB/c小鼠右腹部

5、皮下注射.A20細(xì)胞建立B淋巴瘤模型,瘤內(nèi)注射腺病毒Ad LIGHT進(jìn)行治療,證實(shí)Ad LIGHT可顯著抑制腫瘤生長并延長小鼠生存期,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性和非特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng).用滅活的轉(zhuǎn)染了LIGHT腺病毒的A20細(xì)胞(小鼠B淋巴瘤細(xì)胞)制備成腫瘤疫苗免疫小鼠,可明顯抑制A20淋巴瘤再次攻擊后的腫瘤生長,誘導(dǎo)出針對A20的特異性CTL反應(yīng),證實(shí)LIGHT修飾的該疫苗可激發(fā)機(jī)體對A20淋巴瘤的免疫保護(hù)作用. 第一部分:腺病毒介

6、導(dǎo)的LIGHT對A20細(xì)胞的感染及其生物學(xué)活性的鑒定 我們首先用重組腺病毒Ad LIGHT及對照病毒Ad IracZ感染A20細(xì)胞,應(yīng)用RT-PCR檢測了LIGHT在mRNA水平上的表達(dá),用WesternBlot檢測了LIGHT在蛋白水平上的表達(dá).結(jié)果顯示,腺病毒攜帶的LIGHT能在A20細(xì)胞中有效地表達(dá).在我們的實(shí)驗(yàn)中研究發(fā)現(xiàn),在抗小鼠CD3存在的情況下,感染了Ad LIGHT的A20細(xì)胞能夠有效刺激T淋巴細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)IF

7、N-γ的分泌,且Ad LIGHT具有刺激T淋巴細(xì)胞增殖的作用.我們用流式檢測了感染LIGHT腺病毒的A20細(xì)胞表面分子的表達(dá)情況以及凋亡情況.結(jié)果發(fā)現(xiàn),Ad LIGHT可以誘導(dǎo)細(xì)胞表面分子ICAM-1、Fas的表達(dá),從而提高A20細(xì)胞的抗原提呈功能和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡能力;Ad LIGHT腺病毒誘導(dǎo)了A20細(xì)胞的凋亡. 第二部分:腺病毒介導(dǎo)的LIGHT對小鼠B淋巴瘤的抗腫瘤作用研究 首先我們研究了LIGHT基因修飾的A20

8、淋巴瘤細(xì)胞制備的瘤苗對腫瘤攻擊的預(yù)防作用.Ad LIGHT,Ad LacZ轉(zhuǎn)染A20細(xì)胞,并設(shè)PBS為對照,絲裂霉素滅活,將滅活的A20細(xì)胞(A20/LIGHT、A20/LacZ、A20/PBS)皮下注射至BALB/c小鼠什么部位,并設(shè)PBS為對照.對小鼠免疫兩次,免疫后7天,對側(cè)腹部皮下注射活的A20細(xì)胞,觀察成瘤情況和生存期,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與PBS和Ad LacZ對照組相比,應(yīng)用A20/LIGHT進(jìn)行預(yù)防,能夠有效地抑制腫瘤的生長并延長

9、了荷瘤小鼠的生存期.我們還檢測了免疫后10天小鼠的CTL殺傷活性與NK活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn),用A20/LIGHT免疫的小鼠其脾細(xì)胞的NK和CTL活性均有提高,說明轉(zhuǎn)染了AdLIGHT的A20細(xì)胞比未曾修飾的A20細(xì)胞更能有效地增強(qiáng)針對A20的特異性CTL反應(yīng)以及提高NK細(xì)胞的殺傷活性,從而增強(qiáng)其抗腫瘤作用,誘發(fā)機(jī)體針對A20淋巴瘤的免疫保護(hù)作用. 其次我們研究了Ad LIGHT腺病毒瘤內(nèi)注射對小鼠B淋巴瘤的治療作用及其免疫機(jī)理.收集對

10、數(shù)生長期的A20細(xì)胞,注射至BALB/c小鼠右腹部皮下,建立B淋巴瘤模型,7天后隨機(jī)分為3組,瘤內(nèi)注射腺病毒Ad IIGHT(2×10<'8>PFU病毒/100μl/只)進(jìn)行治療,并設(shè)Ad LacZ和PBS為對照組. 對小鼠共治療三次,每星期治療一次. 我們用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小并觀察荷瘤小鼠的生存期,結(jié)果發(fā)現(xiàn),PBS和Ad LacZ組小鼠腫瘤生長迅速,Ad LIGHT組小鼠腫瘤生長緩慢,并于第14天腫瘤開始逐漸減小,且有71.

11、43﹪的腫瘤最終消退并得到了長期存活(>90天).在90天的觀察期內(nèi),PBS和Ad LacZ組小鼠在40天左右全部死亡,而Ad LIGHT組小鼠的生存率為71.43﹪,顯著延長了小鼠的生存期. 接著,我們檢測了小鼠脾細(xì)胞的NK和CTL殺傷活性,研究發(fā)現(xiàn),Ad LIGHT.治療組增強(qiáng)了小鼠脾細(xì)胞的NK和CTL殺傷活性,明顯高于對照組,提示機(jī)體被誘導(dǎo)產(chǎn)生了特異性和非特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng). 對治療后的各組小鼠的腫瘤組織做了病

12、理切片,結(jié)果顯示,伴隨著瘤內(nèi)炎性細(xì)胞(中性粒細(xì)胞,淋巴細(xì)胞)中等程度的浸潤,Ad LIGHT組較.Ad LacZ組和PBS組有更多的炎性細(xì)胞,且觀測到部分腫瘤組織發(fā)生壞死.炎性細(xì)胞對腫瘤的浸潤和腫瘤組織的壞死有利于機(jī)體對腫瘤的清除. 我們還用半定量PCR檢測了腫瘤組織中趨化因子CCL21、IP-10、Mig的表達(dá)情況.結(jié)果發(fā)現(xiàn),在Ad LIGHT組三者均有表達(dá),Ad LacZ組IP-10、Mig也有少量.的表達(dá),說明腺病毒介導(dǎo)的

13、LIGHT可以誘導(dǎo)趨化因子的產(chǎn)生,從而發(fā)揮趨化T淋巴細(xì)胞和抑制腫瘤血管形成的作用. 最后我們檢測了Ad LIGHT治療是否誘導(dǎo)了小鼠長遠(yuǎn)性的保護(hù)性免疫力,我們將Ad LIGHT治療組長期存活的小鼠,在左腹皮下接種A20細(xì)胞,同時以未經(jīng)任何處理的小鼠作為對照組,皮下接種同數(shù)量的A20細(xì)胞,觀察每組小鼠成瘤比率和存活時間. 結(jié)果發(fā)現(xiàn),Ad LIGHT治療誘發(fā)小鼠產(chǎn)生了針對A20細(xì)胞的特異性保護(hù)免疫. 1.腺病毒介導(dǎo)的

14、LIGHT能在A20細(xì)胞中有效表達(dá),誘導(dǎo)了A20細(xì)胞表面共刺激分子ICAM-1以及分子Fas的表達(dá)增加,可有效刺激T淋巴細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)IFN-γ的分泌;同時L,IGHT還可誘導(dǎo)部分A20細(xì)胞發(fā)生凋亡. 2.Ad LiGHT修飾的A20細(xì)胞作為瘤苗免疫小鼠,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生對A20淋巴瘤細(xì)胞攻擊的免疫保護(hù)作用,增強(qiáng)小鼠脾細(xì)胞的NK細(xì)胞和CTL細(xì)胞的殺傷活性,部分小鼠在腫瘤攻擊后可長期存活. 3.瘤內(nèi)注射Ad LIGHT治療小

15、鼠B淋巴瘤,可有效抑制腫瘤生長并促進(jìn)其消退,部分小鼠得到了長期存活.AdLIGHT治療增強(qiáng)了小鼠脾細(xì)胞的NK和CTL殺傷活性,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了特異性和非特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng).AdLIGHT治療后存活的小鼠還產(chǎn)生了針對A20淋巴瘤的長遠(yuǎn)性特異性保護(hù)免疫. 4.Ad LIGHT治療能誘導(dǎo)腫瘤組織趨化因子CCL21、IP-10和Mig的表達(dá),LIGHT治療組小鼠腫瘤組織內(nèi)有較多的炎性細(xì)胞浸潤和壞死. 上述結(jié)果說明: 用