Laptm5 3’UTR對小鼠B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制.pdf

1、目的:
　　本研究旨在探討Laptm5的3'UTR是否具有影響小鼠B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖能力的調(diào)節(jié)功能，為進(jìn)一步研究其競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)功能奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、利用Real-time PCR技術(shù)和Western Blot技術(shù)在小鼠B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞和正常B細(xì)胞中檢測Laptm5 mRNA及蛋白水平的表達(dá)情況。
　　2、構(gòu)建Laptm53'UTR野生型及突變型逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒，其中突變型表

2、達(dá)質(zhì)粒是將Laptm53'UTR序列中與miR-17-3p互補(bǔ)的序列進(jìn)行突變。將質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，包裝得到病毒。用所收集到的病毒感染小鼠B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞38B9細(xì)胞系，感染后加入嘌呤霉素(Puromycin)篩選，用Real-time PCR法檢測感染效率，評價(jià)Laptm53'UTR野生型和突變型序列在細(xì)胞內(nèi)的過表達(dá)情況。
　　3、通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察過表達(dá)野生型和突變型Laptm53'UTR的小鼠B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增

3、殖情況改變。
　　4、用Real-time PCR法檢測生物信息學(xué)預(yù)測的其中一個(gè)miR-17-3p在小鼠B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞和正常B細(xì)胞中的表達(dá)。分別構(gòu)建miR-17-3p的表達(dá)質(zhì)粒和含有野生型及突變型Laptm53'UTR序列的熒光素酶融合基因質(zhì)粒，利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-17-3p對Laptm53'UTR的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果:
　　1、在小鼠B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞(38B9)中，Laptm5 mRNA水平及蛋

4、白水平均較正常B細(xì)胞低，提示Laptm5在B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展中可能存在抑癌作用。
　　2、成功構(gòu)建野生型和突變型Laptm53'UTR逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染和嘌呤霉素篩選后，Real-time PCR結(jié)果顯示與空載體對照組比較野生型和突變型Laptm53'UTR均在細(xì)胞內(nèi)得到了高表達(dá)。有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3、38B9過表達(dá)野生型Laptm53'UTR后，細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示與空載體對照組及突

5、變組相比，細(xì)胞數(shù)目明顯減少;CCK-8試劑盒檢測結(jié)果同樣顯示，過表達(dá)Laptm53'UTR組細(xì)胞可明顯抑制細(xì)胞數(shù)量的增加(P＜0.01)。
　　4、Real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-17-3p在小鼠B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于正常B細(xì)胞。miR-17-3p分別與帶有野生型和突變型Laptm53'UTR的熒光素酶融合基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后，含有野生型Laptm53'UTR序列的熒光素酶活性明顯低于含有突變型Laptm53'

6、UTR序列者。
　　結(jié)論:
　　小鼠B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中Laptm5的表達(dá)明顯降低，過表達(dá)Laptm53'UTR可抑制小鼠B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的增殖。在小鼠B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中，miR-17-3p的表達(dá)明顯升高，且對Laptm53'UTR具有靶向負(fù)調(diào)節(jié)作用。這一結(jié)論提示Laptm53'UTR可能具有競爭性結(jié)合miR-17-3p的作用，并進(jìn)而影響miR-17-3p的其他靶蛋白的表達(dá)，這是Laptm53'UTR能夠影響小鼠B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)