CIK細胞與DC共培養(yǎng)抗B細胞淋巴瘤作用研究.pdf

1、目的:
　　 惡性淋巴瘤(Malignant Lymphoma，ML)是起源于淋巴結及淋巴組織的一組高度異質性、具有侵襲性的造血系統惡性腫瘤，其發(fā)病率有逐年上升趨勢。近年來，隨著新藥尤其是靶向藥物的不斷問世，惡性淋巴瘤的治療水平有了長足的進步，部分病種的完全緩解(complete remission; CR)率已達50％-70％，甚至更高，但最終僅有部分患者可獲得長期無病生存，而相當比例的患者疾病復發(fā)，其主要原因為微小殘留病灶的

2、存在。過繼細胞免疫治療(adoptive cellularimmunotherapy，ACI)是向腫瘤患者輸注自體或異體具有抗腫瘤活性，能直接或間接發(fā)揮抗腫瘤效應的免疫細胞，對體內殘存腫瘤細胞具有更直接更有效的殺滅作用，從而達到消滅腫瘤細胞、阻止腫瘤轉移和復發(fā)的作用。細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer cell，CIK)是體外經抗CD3單抗、干擾素-γ（IFN-γ）、白細胞介素-2(IL-2)等細胞因

3、子聯合作用產生的一類具有較強抗腫瘤活性和非MHC限制殺瘤特點的T淋巴細胞。樹突狀細胞(dendritic cell，DC)是目前認為功能最強的抗原體提呈細胞，能有效的將腫瘤抗原提呈給T淋巴細胞，在腫瘤細胞與T細胞間起到橋梁作用。多項研究提示，CIK細胞與DC共培養(yǎng)后表現出更強的殺瘤作用，并在多種腫瘤領域獲得較好的效果，但其臨床應用主要集中于自體DC-CIK細胞免疫治療，且CIK細胞與DC共培養(yǎng)細胞對B-NHL體外殺傷作用研究很少。

4、>　　 本研究一方面觀察健康人群CIK細胞與DC混合培養(yǎng)過程中細胞數量、細胞免疫表型、細胞因子分泌水平及對Raji細胞殺傷活性的變化，以單純CIK細胞抗腫瘤作用相比較，以求進一步證實CIK細胞與DC共培養(yǎng)后，其增殖活性和殺傷活性顯著提高;另一方面，比較健康人群與B-NHL患者DC-CIK細胞培養(yǎng)第15d時細胞數量、細胞免疫表型、細胞因子分泌水平及對Raji細胞殺傷活性明確兩者之間的差異;在此基礎上，進一步探討健康人群DC-CIK細胞對

5、不同B-NHL細胞的殺傷活性。為異體DC-CIK細胞免疫治療更好的應用于臨床做準備。
　　 方法:
　　 1.抽取健康志愿者或B-NHL患者外周血50ml，常規(guī)單個核細胞提取法分離提取單個核細胞，于37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育2h;收集貼壁細胞用于誘導培養(yǎng)DC，非貼壁細胞誘導培養(yǎng)CIK細胞，分別培養(yǎng)9d;將成熟DC與CIK細胞混合培養(yǎng)6d，以單純CIK細胞作為對照組。
　　 2.用倒置顯微鏡觀察細胞形

6、態(tài)變化;細胞計數儀采用臺盼藍染色法計數。
　　 3.采用流式細胞儀于培養(yǎng)第9d檢測DC細胞免疫表型;于第12d、15d檢測CIK細胞及DC與CIK細胞共培養(yǎng)細胞免疫表型。
　　 4.于培養(yǎng)第15d收集培養(yǎng)細胞上清液，采用ELISA法檢測IFN-γ、IL-12和TNF-α細胞因子分泌量。
　　 5.采用MTT比色法檢測效靶細胞比5∶1、10∶1、20∶1條件下，CIK細胞、DC-CIK細胞對B-NHL細胞的殺傷活性

7、。
　　 結果:
　　 1.CIK細胞與DC共培養(yǎng)后，其增殖活性和殺傷活性顯著增強。共培養(yǎng)細胞組CD3+CD8+和CD3+CD56+雙陽性細胞比例、細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-12分泌量均明顯高于單純CIK細胞組，差異有統計學意義。
　　 2.健康人群和NHL患者相比，細胞培養(yǎng)第15d DC-CIK細胞數量、CD3+CD8+和CD3+CD56+雙陽性細胞比例、細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-12分

8、泌量均明顯增加。2組細胞對Raji細胞均顯示出較強的殺傷活性，在同一效靶比條件下，健康人群組DC-CIK細胞抗腫瘤作用明顯優(yōu)于NHL患者組。
　　 3.健康人群DC-CIK細胞對不同B-NHL細胞（SU-DHL4細胞、Raji細胞、KARPAS422細胞）均有較強細胞毒作用，且隨效靶比增加殺傷作用增強。
　　 結論:
　　 CIK細胞與DC共培養(yǎng)后，其增殖活性和殺傷活性顯著提高。與NHL患者相比，細胞培養(yǎng)第15d