酪氨酸磷酸化蛋白和胞質動力蛋白在對蝦白斑癥病毒(WSSV)感染過程中的作用研究.pdf

1、為研究蛋白酪氨酸磷酸化在WSSV感染過程中所發(fā)揮的作用,本論文綜合運用磷酸化特異性流式細胞術、激光共聚焦顯微技術和蛋白免疫印跡法(western blotting)檢測了WSSV感染后中國對蝦血細胞中蛋白酪氨酸磷酸化水平的變化,并通過基質輔助激光解吸電離飛行時間串聯(lián)質譜( Matrix-assisted laser desorption/ionization tandem mass spectrometry:MALDI-TOF-MS/M

2、S)鑒定了血細胞內在WSSV感染過程中發(fā)生酪氨酸磷酸化的蛋白質。以期為WSSV和宿主細胞相互作用過程的研究提供理論基礎。
　　研究表明,胞質動力蛋白在很多病毒的感染過程中發(fā)揮轉運病毒的功能。為研究其在 WSSV感染過程中的作用,本論文首次克隆得到了胞質動力蛋白中間鏈基因,綜合運用實時熒光定量PCR檢測技術、激光共聚焦顯微技術和RNA干擾技術研究了胞質動力蛋白在 WSSV感染過程中基因表達量的變化及其在WSSV轉運過程中的作用。本研

3、究為探索WSSV在宿主細胞內的轉運過程提供了研究線索和理論基礎。具體研究內容包括以下幾個部分:
　　(1)利用磷酸化特異性流式細胞術檢測了WSSV感染后中國對蝦血細胞內蛋白酪氨酸磷酸化水平的變化。結果顯示,WSSV感染后,中國對蝦血細胞分為兩群:R2和R3,其中R2群血細胞表現(xiàn)出蛋白酪氨酸磷酸化水平的下降,而R3群血細胞則表現(xiàn)出蛋白酪氨酸磷酸化水平的升高。隨著 WSSV感染進程的持續(xù),總體血細胞的平均蛋白酪氨酸磷酸化水平表現(xiàn)出顯著

4、的動態(tài)變化并呈現(xiàn)出上調趨勢,分別在WSSV感染后1和12 h出現(xiàn)兩個峰值。
　　(2)通過激光共聚焦顯微鏡觀察到的WSSV感染后中國對蝦血細胞內蛋白酪氨酸磷酸化信號強度變化和western blotting檢測到的中國對蝦血細胞內蛋白酪氨酸磷酸化蛋白條帶粗細的變化與流式檢測的中國對蝦血細胞內蛋白酪氨酸磷酸化水平的變化趨勢基本一致。激光共聚焦顯微觀察結果顯示酪氨酸磷酸化蛋白既存在于血細胞質中也存在于細胞核中,但是WSSV感染后細胞核

5、中酪氨酸磷酸化水平的變化較細胞質顯著。Western blotting共檢測到五個酪氨酸磷酸化蛋白,經(jīng)質譜鑒定為α2-巨球蛋白(Alpha-2-macroglobulin:A2M)、熱應激蛋白70(Heat shock protein70:HSP70)、組蛋白H3(Histone H3)、組蛋白H2A(Histone H2A)和組蛋白H4(Histone H4),其中HSP70、組蛋白H3和組蛋白H4只在WSSV感染后才發(fā)生酪氨酸磷酸化

6、;利用實時熒光定量技術檢測了中國對蝦血細胞內組蛋白H2A、H3和H4基因表達量在WSSV感染后的變化,三者在病毒感染后均顯著性上調表達。
　　(3)首次利用RACE技術從甲殼綱動物—中國對蝦血細胞克隆得到了胞質動力蛋白中間鏈(FcDYNCI)基因全序列,為研究胞質動力蛋白在WSSV轉運過程中的作用奠定了基礎。結果顯示,FcDYNCI cDNA序列全長2582 bp,含有一個1983 bp的開放閱讀框,該開放閱讀框可以編碼一個含有6

7、60個氨基酸的多肽,其理論分子量和理論等電點分別為73.4 kDa和5.16。通過與昆蟲綱的四種DYNCI蛋白的多序列比對分析,結果表明FcDYNCI屬于胞質動力蛋白Ⅱ型中間鏈蛋白。
　　(4)利用實時熒光定量技術檢測了FcDYNCI基因在健康中國對蝦體內各組織中的表達差異,結果顯示,FcDYNCI基因在血細胞中的表達量遠高于其他組織;WSSV感染后,中國對蝦血細胞內FcDYNCI基因表現(xiàn)出顯著性上調表達,約為未感染W(wǎng)SSV中國對

8、蝦血細胞內FcDYNCI基因表達量的3倍;WSSV感染12 h后,對蝦血細胞內的胞質動力蛋白能夠與WSSV共定位。
　　(5)利用 RNAi技術對中國對蝦體內 FcDYNCI基因進行了沉默,經(jīng)過兩次FcDYNCI dsRNA注射后,血細胞內FcDYNCI基因表達量和蛋白量都出現(xiàn)顯著性下調;在沉默F(xiàn)cDYNCI基因后,血細胞內WSSV三種基因ie1、wsv477和vp28在24 h均表現(xiàn)出最大程度的下調表達,分別約為對照組的1/27