八肋游仆蟲中心蛋白在溶液中的聚集性質(zhì)研究.pdf

1、中心蛋白(Centrin)是屬于EF-hand鈣結(jié)合蛋白超家族的分子量較小(約20kD)的酸性蛋白。最初中心蛋白是作為鞭毛單細胞生物中連接核和鞭毛器的纖維的主要成分被鑒定得到的，隨后發(fā)現(xiàn)中心蛋白是中心粒，中心體和有絲分裂紡錘體極體中一種廣泛存在的成分，與細胞的分裂，細胞中中心體的定位、定向，紡錘體極體分離，微管切除，纖維系統(tǒng)的收縮等有關(guān)。其中基于中心蛋白的纖維系統(tǒng)的收縮現(xiàn)象，與在Ca2+存在下，不論是酵母，藻類或是人類的中心蛋白都會形成

2、多聚體密切相關(guān)。
　　八肋游仆蟲中心蛋白(EoCen)是從一種在進化上處于特殊地位的單細胞真核生物——八肋游仆蟲中克隆得到的，將其作為研究金屬離子(Ca2+、Ln3+)進入體內(nèi)的靶蛋白模型，對于闡明稀土生物效應的分子基礎(chǔ)具有重要的意義。EoCen共含有168個氨基酸殘基，與人中心蛋白1(HsCen1)，人中心蛋白2(HsCen2)和人中心蛋白3(HsCen3)的序列同源性分別為60％，62％和66％，與研究最為廣泛的EF-hand

3、結(jié)構(gòu)蛋白鈣調(diào)蛋白(CaM)的同源性為50％。最近，八肋游仆蟲中心蛋白N端結(jié)構(gòu)域的NMR結(jié)構(gòu)剛剛被報道(2joj.pdb)。與CaM一樣，EoCen由兩個相互獨立的結(jié)構(gòu)域組成，中間由一段彈性螺旋相連。每個結(jié)構(gòu)域都由一對螺旋—環(huán)—螺旋結(jié)構(gòu)的EF-hand結(jié)構(gòu)基元組成，每個結(jié)構(gòu)基元能夠結(jié)合一個Ca2+。與其他物種的中心蛋白一樣，在Ca2+存在下，EoCen也會形成多聚體，這一點與CaM明顯不同。本文將著重研究金屬離子誘導下八肋游仆蟲中心蛋白在

4、溶液中的聚集性質(zhì)。
　　本文用定點突變的方法構(gòu)建得到了九個酪氨酸突變體(Y46F, Y72F,Y79F, N-Y46F, N-Y72F, N-Y79F, N-Tyr46，N-Tyr72，N-Tyr79)重組質(zhì)粒。通過DNA序列分析確定所得到的突變體只含有目的位點的突變基因，而不包含其它任何位點的隨機突變。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)細胞中，在誘導劑IPTG誘導下實現(xiàn)蛋白可溶性表達。融合蛋白經(jīng)PPase酶切和GST親和層

5、析之后得到目的蛋白。另外，將野生型蛋白(EoCen)和本課題組之前構(gòu)建完成的蛋白片段分子(N-EoCen，C-EoCen，△23EoCen，P23，P123)誘導表達純化得到目的蛋白。經(jīng)SDS-PAGE分析顯示所有蛋白均不含雜蛋白條帶，達到實驗所需純度。
　　首先對金屬離子誘導下的EoCen的聚集性質(zhì)進行了系統(tǒng)的分析表征。含有不同結(jié)構(gòu)域的蛋白片段分子(EoCen，N-EoCen，C-EoCen，△23EoCen，P23，P123)

6、的化學交聯(lián)實驗表明蛋白的N末端是聚集發(fā)生的主要部位。天然膠電泳顯示在Lu3+存在下，只有完整的野生型蛋白分子能夠顯示出多聚體條帶。用共振光散射(RLS)的方法分析了多種理化因素，包括溫度，蛋白濃度，離子強度，酸度對Lu3+誘導的EoCen聚集性質(zhì)的影響。不同金屬離子與蛋白結(jié)合的對照實驗表明，Lu3+或Ca2+在EoCen N端的結(jié)合有利于蛋白的聚集，且Lu3+表現(xiàn)出更強的促進效應，而Mg2+的結(jié)合不能起到相同或相似的作用。2-ptolu

7、idinylnaphthalene-6-sulfonate(TNS)結(jié)合實驗以及離子強度實驗證明Lu3+結(jié)合誘導的EoCen的聚集與蛋白疏水區(qū)的暴露密切相關(guān)。酸度效應實驗中，不同片段分子蛋白的對照研究表明靜電作用在EoCen的聚集過程中影響較小。
　　酪氨酸殘基是組成蛋白——蛋白相互作用的“熱點”區(qū)域的主要氨基酸殘基之一，且其具備發(fā)光性質(zhì)。本課題組之前的工作以Tb3+作為熒光探針證明EoCen存在4個Ca2+結(jié)合位點，且Tb3+敏

8、化熒光的增強主要來源于EoCen的N末端所含的三個酪氨酸殘基（Tyr-46，Tyr-72，Tyr-79）與結(jié)合的Tb3+之間的能量轉(zhuǎn)移。為了找到EoCen聚集時的蛋白——蛋白相互作用過程中，以及EoCen與Tb3+結(jié)合時的能量轉(zhuǎn)移過程中起重要作用的酪氨酸殘基，本文用定點突變的方法得到了九個分別含有一個或兩個酪氨酸殘基的EoCen突變體。實驗結(jié)果顯示79位酪氨酸的突變對熒光敏化的影響最為明顯，使得Tb3+的熒光敏化強度降低達到50％之多。

9、F(o)rster能量轉(zhuǎn)移機理得出79位酪氨酸與蛋白N端結(jié)合的兩個Tb3+之間的距離最近(8.8±0.2(A))。穩(wěn)態(tài)熒光及時間分辨熒光參數(shù)的測定表明處于疏水環(huán)境中的Tyr-79量子產(chǎn)率最高(3.27×10-2)，熒光壽命相對較長(2.20 ns)，且平均壽命數(shù)據(jù)的標準偏差(σ=0.271 ns)最小。另外，分子模擬顯示Tyr-79的酚羥基與Asn-39的側(cè)鏈上的氧原子之間形成了重要的氫鍵。酪氨酸與Tb3+的熒光動力學實驗證明酪氨酸熒光

10、的猝滅絕大部分來源于EoCen在金屬離子結(jié)合誘導下產(chǎn)生的聚集，研究發(fā)現(xiàn)不同酪氨酸突變體所表現(xiàn)出的熒光猝滅程度有所不同。以全分子單酪氨酸突變體(Y46F，Y72F，Y79F)為研究對象，經(jīng)RLS和化學交聯(lián)分析顯示，Tyr-79是蛋白聚集過程中貢獻最大的酪氨酸殘基。
　　細胞滲透型小分子抑制劑Monastrol通常被認為能夠特異性地抑制驅(qū)動蛋白Eg5的活性，導致細胞有絲分裂停滯和單極紡錘體的形成，從而表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性。中心蛋白作

11、為一種附著于中心體上的廣泛存在的蛋白，在中心體復制過程中發(fā)揮著重要的作用。已有報道稱中心體的大量增殖很可能與癌癥有關(guān)。本文研究發(fā)現(xiàn)Monastrol在體內(nèi)能夠有效抑制轉(zhuǎn)化有pGEX-6p-1-EoCen重組質(zhì)粒的大腸桿菌細胞的生長，以及八肋游仆蟲的增殖分裂;在體外能夠抑制Lu3+誘導的EoCen的聚集。合成得到的兩個Monastrol類似物（Compound1和Compound2）不能達到相同的抑制效果。熒光滴定實驗表明1個EoCen蛋

12、白分子能夠結(jié)合4個Monastrol分子，并且得到不同溫度下EoCen與Monastrol相互作用的結(jié)合常數(shù)。熱力學數(shù)據(jù)分析顯示EoCen與Monastrol結(jié)合的主導作用力為疏水作用力。Monastrol對蛋白聚集抑制的程度與金屬離子結(jié)合所誘導的蛋白疏水區(qū)的暴露密切相關(guān)。
　　蜂毒素(Melittin)是一種從蜂毒中提取出的由26個氨基酸殘基構(gòu)成的兩親性小分子肽，被廣泛用作研究蛋白——蛋白相互作用或者蛋白—脂類相互作用的工具。本