淀粉樣蛋白(Aβ)突變體的制備、性質(zhì)及其神經(jīng)細(xì)胞毒性機(jī)制研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是德國(guó)學(xué)者Alois Alzheimer于1907年首次報(bào)道的一種常發(fā)于老年人當(dāng)中的神經(jīng)退行性疾病。全世界大約有3000萬(wàn)人患有阿爾茨海默病，并且患病人數(shù)正在逐年增加，嚴(yán)重威脅到人類的健康。AD患者的主要臨床表現(xiàn)為不同程度的記憶力喪失、認(rèn)知能力降低、語(yǔ)言功能喪失、行為和感情活動(dòng)異常。AD的病理特征包括神經(jīng)元數(shù)量減少，顆粒空泡變性、淀粉樣斑塊和神經(jīng)纖維纏結(jié)。AD的發(fā)病原因十分復(fù)雜

2、，可能是多種因素相互作用的結(jié)果，迄今為止，其確切的發(fā)病機(jī)理還是一個(gè)未解之謎。
　　淀粉樣蛋白Aβ(amyloid beta peptide)是AD患者腦中老年斑(senile plaques，SP)的主要組成成分，在AD的發(fā)病機(jī)制的研究中占據(jù)著中心地位。在AD患者的腦內(nèi)，Aβ由淀粉樣前體蛋白APP(amyloid precursor protein，APP)酶切產(chǎn)生，釋放進(jìn)入突觸，與同樣釋放進(jìn)入突觸中的游離狀態(tài)的Cu2+，Zn2+

3、等金屬離子發(fā)生作用。在AD病人腦中，金屬離子(Cu2+，Zn2+)能夠誘導(dǎo)Aβ聚集，同時(shí)促進(jìn)自由基的產(chǎn)生，進(jìn)一步加劇細(xì)胞毒性。與人淀粉樣蛋白(human amyloid beta, hAβ)的氨基酸序列相比，鼠淀粉樣蛋白(mouse amyloid beta, mAβ)的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)了三個(gè)位點(diǎn)的氨基酸突變，即第五位的精氨酸變成了甘氨酸(R5G)，第十位的酪氨酸變成了苯丙氨酸(Y10F)和第十三位的組氨酸變成了精氨酸(H13R)。成年鼠

4、類的大腦中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)老年斑，可能與這三個(gè)位點(diǎn)的氨基酸密切相關(guān)。研究表明，Y10F-Aβ1-40的神經(jīng)細(xì)胞毒性比野生型Aβ1-40弱，表明Aβ中第10位的酪氨酸在Aβ的神經(jīng)細(xì)胞毒性中發(fā)揮著重要的作用。除了Aβ在腦中的聚集以外，AD的細(xì)胞病理學(xué)特征還包括血紅素代謝紊亂。體外實(shí)驗(yàn)表明化學(xué)合成的Aβ通過(guò)Arg5和Hisl13與血紅素結(jié)合后形成具有過(guò)氧化物酶活性復(fù)合物。通過(guò)比較mAβ和hAβ的性質(zhì)和神經(jīng)細(xì)胞毒性的差異，我們?cè)噲D了解成年鼠大腦中沒(méi)有淀

5、粉樣斑塊的原因及其相關(guān)分子機(jī)制。通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了mAβ和hAβ，我們通過(guò)圓二色譜，硫磺素?zé)晒夤庾V，ANS熒光光譜和透射電鏡檢測(cè)了mAβ和hAβ的聚集情況。細(xì)胞層次上使用熒光探針檢測(cè)了ROS產(chǎn)生情況，同時(shí)測(cè)定了細(xì)胞活性。我們還監(jiān)測(cè)了mAβ和hAβ與Heme的結(jié)合以及形成的復(fù)合物的過(guò)氧化物酶活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)于hAβ而言，mAβ聚集生成淀粉樣纖維的能力較弱和疏水能力都較小。透射電鏡顯示，mAβ聚集形成稀少狹長(zhǎng)的纖維。mAβ的神經(jīng)

6、細(xì)胞毒性更低，可能的原因?yàn)閙Aβ誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的ROS更少。相對(duì)于hAβ與Heme形成的復(fù)合物，mAβ與Heme形成的復(fù)合物在412nm處沒(méi)有特征吸收峰，過(guò)氧化物酶活性較低。我們推測(cè)，鼠大腦中沒(méi)有淀粉樣斑塊的原因?yàn)閙Aβ聚集形成纖維的能力弱和神經(jīng)細(xì)胞的毒性低。
　　現(xiàn)在已知Aβ在某些人群中具有基因突變的現(xiàn)象，這些突變會(huì)導(dǎo)致人群中早發(fā)性AD。與野生型的人淀粉樣蛋白氨基酸序列相比，部分荷蘭人中第22位的谷酸胺變成了谷氨酰胺(E22Q)，

7、部分大阪人中第22位的谷氨酸缺失(△E22)。我們采用分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)獲得了高純度的E22Q-Aβ1-42和△E22Aβ1-42。通過(guò)圓二色譜，硫磺素?zé)晒夤庾V，ANS熒光光譜和透射電鏡檢測(cè)了E22Q-Aβ1-42和△E22Aβ1-42的聚集情況。細(xì)胞層次上使用熒光探針檢測(cè)了ROS產(chǎn)生情況，同時(shí)測(cè)定了細(xì)胞活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)于hAβ1-42而言，E22Q-Aβ1-42和△E22 Aβ1-42聚集生成淀粉樣纖維的能力和疏水能力

8、都變?nèi)酢22Q-Aβ1-42和△E22Aβ1-42的神經(jīng)細(xì)胞毒性比野生型Aβ1-42更高，可能的原因?yàn)镋22Q-Aβ1-42和△E22Aβ1-42誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的更多ROS。
　　小角X射線散射可以用來(lái)測(cè)量顆粒大小為1-100 nm的粒子的分布，而Aβ聚集后，其顆粒粒徑恰好在這個(gè)范圍。因此，我們采用小角X射線散射研究了Aβ的顆粒隨時(shí)間的分布情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著時(shí)間的增加，Aβ逐漸聚集，旋轉(zhuǎn)半徑逐漸增大。加入金屬離子(Cu2+和