干預β-淀粉樣前體蛋白裂解酶基因減少神經細胞β淀粉樣蛋白的產生.pdf

1、隨著人類平均壽命的不斷延長，阿爾茨海默?。ˋlzlleimer's disease，AD）越來越成為影響老年人生活的一大疾病。在國外阿爾茨海默病是導致老年人智能損害的最常見原因，超過65歲的人群中有大約5-10％的人患有阿爾茨海默病，而85歲以上的老年人有超過一半的人患有阿爾茨海默病。在國內，我們一度認為血管性癡呆的發(fā)病率高于AD，但是最近幾年的流行病學調查顯示，AD在我國的發(fā)病率也處于各種癡呆的第一位。阿爾茨海默病是一種中樞神經系統(tǒng)退

2、行性變性疾病?；颊哂捎谏窠浖毎拇罅克劳龆饾u出現(xiàn)記憶能力、語言能力和直覺能力的全面下降，最終會因腦衰竭而死亡。阿爾茨海默病最具有特異性的病理特征的是老年斑、神經纖維纏結，以及神經突觸和神經細胞的丟失。而腦組織內老年斑的形成是造成阿爾茨海默病的主要原因，而且在阿爾茨海默病的早期出現(xiàn)。 老年斑的主要成分是39-43氨基酸長的β淀粉樣肽（β-amyloid peptide，Aβ），Aβ由β淀粉樣前體蛋白（β-amyloid prec

3、ursor protein，APP）水解而來，APP可以被三種水解酶裂解：α-secretase、β-secretase、γ-secretase。Α-secretase的水解位點在APP跨膜區(qū)的Aβ區(qū)內，產生一長的可溶性的胞外結構α-APPs和一83堿基的C末端（COOH-terminal fragment，CTF）--C83，不產生Aβ。而淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）經β淀粉樣前體蛋白裂

4、解酶（β-siteAPP cleaving enzyme，BACE1）和γ-分泌酶裂解產生Aβ。淀粉級聯(lián)學說認為老年斑的核心成分β-淀粉樣肽（β-amyloid peptide，Aβ）是AD發(fā)生的主要原因。BACE1（β-secretase）酶是Aβ形成的關鍵酶。 老年斑或Aβ可以促進AD的疾病進展，而且是AD臨床表現(xiàn)的關鍵性因素。Aβ具有神經毒性作用，當Aβ在腦組織中沉積超過一定的時間后，就可以造成神經細胞的死亡、腦內的炎癥性

5、反應、以及其他的可以促進AD病情進展的有害的病理改變。而且，大量的研究顯示，Aβ在AD患者疾病的早期即出現(xiàn)。 小干擾RNA（siRNA）可謂是引起生物科學研究領域一場變革的工具，siRNA是一種特異性抑制特定基因的有力手段。RNAi不但可以用來快速的判斷基因的功能，而且目前已經在病毒感染、腫瘤和遺傳性疾病中進行了大量的研究，并取得了良好的效果。 減少Aβ的生成成為治療AD的主要靶位點。目前唯一得到FAD許可的治療藥物只有

6、乙酰膽堿酯酶抑制劑（如tacrine，donepezil，rivastigmine，galantamine），而其他的藥物治療正在研究進行中，這些包括：單胺氧化酶抑制劑（如selegiline），抗氧化劑（如Vit E、C），雌激素替代療法和抗炎制劑（如非甾體類抗炎藥物），大多數(shù)的治療均為姑息性治療，而非預防或治愈性手段。目前減少Aβ產生的有許多方法，在本實驗中我們選擇了抑制BACE1基因作為研究的靶基因，通過抑制此該基因的表達來減少A

7、β的生成。我們利用干擾技術應用siRNA對BACE1基因進行干擾抑制，觀察BACE1基因在SK-N-SH細胞株中的表達的改變，以及Aβ產生的改變情況。 研究目的: 1、利用siRNA干擾技術，采用化學合成的siRNA干擾或封閉BACE1基因，觀察BACE1的表達改變。 2、進一步觀察BACE1基因的表達下降后，對體外培養(yǎng)的神經細胞Aβ產生的影響。 實驗方法: 1、人類的神經母細胞瘤細胞SK-N-S

8、H細胞正常情況下，表達APP和BACE1，我們利用SK-N-SH細胞作為體外研究的細胞系。 2、我們利用Ambion公司的Silencer（）pre-designed siRAN Specification system設計合成了3對BACE1基因雙鏈siRNA。3對siRNAs特異性的針對BACE1基因。 3、利用Ambion公司的siPORT NeoFX轉染試劑轉染siRNA入SK-N-SH細胞。為比較、觀察siRN

9、A對BACE1基因的干擾作用，分別使用了10uM-50uM濃度不等的siRNA轉染SK-N-SH細胞，并且分別從12-48小時搜集細胞，進行檢測。 4、應用RT-PCR在的mRNA水平上檢測BACE1基因的表達。 5、應用Western blot方法，檢測轉染48小時后的神經細胞的BACE1蛋白表達。 6、應用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測分

10、泌到細胞外的Aβ42的量。轉染后6小時將siPORT NeoFX轉染試劑換成MEM細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)SK-N-SH細胞，并且每6-12小時收集培養(yǎng)液上清用于檢測Aβ42。 結果: 1、設計合成特異性的siRNAs 我們利用Ambion公司的Silencer（）pre-designed siRAN Specification system設計合成了3對BACE1基因雙鏈siRNA。3對siRNAs特異性的針對BAC

11、E1基因。 2、siRNA轉染SK-N-SH細胞株傳代細胞： 通過對3對siRNA1、siRNA2、siRNA3從不同的工作濃度和不同的轉染后時間進行了觀察，我們發(fā)現(xiàn)40nM和50nM時轉染效率比較高，而且siRNA1和siRNA2對BACE1基因的抑制效應比較好。36小時和48小時的時間點siRNA的封閉效果比較好。 3、RT-PCR結果： 經過對同一標本的β-actin的產物積分光密度校正目的基因的積

12、分光密度值，并按公式相對值=目的基因表達強度/β-actin表達強度，計算出目的基因表達的相對值，我們可以看出siRNA對BACE1基因的封閉效應達到了50％以上，實驗組SK-N-SH細胞的基因抑制效果與對照組比較，具有統(tǒng)計學的顯著性差異。 4、Western blot雜交結果： 利用NIH成像系統(tǒng)對Western blot成像的信號強度進行量化分析，并與β-actin相比較，β-secretase酶的表達有明顯的下降，

13、與對照組比較有顯著性差異。 5、ELISA方法檢測結果： ELISA檢測顯示，處理以siRNA1、siRNA2的SK-N-SH細胞分泌到細胞外的Aβ42較對照組有明顯的減少。但是siRNA3干擾組的細胞所產生的Aβ42雖然也有減少，但是與對照組比較無顯著性差異。 結論: 1，利用siRNA干擾技術可以有效地干預神經細胞內源性的BACE1表達下降，此種抑制作用表現(xiàn)在mRNA和蛋白水平。 2、SK-

14、N-SH細胞內的BACE1基因表達的降低，直接導致了細胞產生并分泌到細胞外Aβ42減少。 改變BACE1基因的表達，可以有效的抑制Aβ42的產生，BACE1基因可以作為AD治療的靶基因。 意義: Aβ的過度生成以及在神經細胞內的沉積，是AD患者腦內的特征性的病理改變，也是促進AD疾病發(fā)展的關鍵因素。因此本研究的意義所在： siRNA可以在體外可以干預BACE1表達，β-secretase酶的活性的降低