干預(yù)β-淀粉樣前體蛋白裂解酶基因減少神經(jīng)細(xì)胞β淀粉樣蛋白的產(chǎn)生.pdf

1、隨著人類平均壽命的不斷延長(zhǎng)，阿爾茨海默?。ˋlzlleimer's disease，AD）越來(lái)越成為影響老年人生活的一大疾病。在國(guó)外阿爾茨海默病是導(dǎo)致老年人智能損害的最常見(jiàn)原因，超過(guò)65歲的人群中有大約5-10％的人患有阿爾茨海默病，而85歲以上的老年人有超過(guò)一半的人患有阿爾茨海默病。在國(guó)內(nèi)，我們一度認(rèn)為血管性癡呆的發(fā)病率高于AD，但是最近幾年的流行病學(xué)調(diào)查顯示，AD在我國(guó)的發(fā)病率也處于各種癡呆的第一位。阿爾茨海默病是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退

2、行性變性疾病?；颊哂捎谏窠?jīng)細(xì)胞的大量死亡而逐漸出現(xiàn)記憶能力、語(yǔ)言能力和直覺(jué)能力的全面下降，最終會(huì)因腦衰竭而死亡。阿爾茨海默病最具有特異性的病理特征的是老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)，以及神經(jīng)突觸和神經(jīng)細(xì)胞的丟失。而腦組織內(nèi)老年斑的形成是造成阿爾茨海默病的主要原因，而且在阿爾茨海默病的早期出現(xiàn)。 老年斑的主要成分是39-43氨基酸長(zhǎng)的β淀粉樣肽（β-amyloid peptide，Aβ），Aβ由β淀粉樣前體蛋白（β-amyloid prec

3、ursor protein，APP）水解而來(lái)，APP可以被三種水解酶裂解：α-secretase、β-secretase、γ-secretase。Α-secretase的水解位點(diǎn)在APP跨膜區(qū)的Aβ區(qū)內(nèi)，產(chǎn)生一長(zhǎng)的可溶性的胞外結(jié)構(gòu)α-APPs和一83堿基的C末端（COOH-terminal fragment，CTF）--C83，不產(chǎn)生Aβ。而淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）經(jīng)β淀粉樣前體蛋白裂

4、解酶（β-siteAPP cleaving enzyme，BACE1）和γ-分泌酶裂解產(chǎn)生Aβ。淀粉級(jí)聯(lián)學(xué)說(shuō)認(rèn)為老年斑的核心成分β-淀粉樣肽（β-amyloid peptide，Aβ）是AD發(fā)生的主要原因。BACE1（β-secretase）酶是Aβ形成的關(guān)鍵酶。 老年斑或Aβ可以促進(jìn)AD的疾病進(jìn)展，而且是AD臨床表現(xiàn)的關(guān)鍵性因素。Aβ具有神經(jīng)毒性作用，當(dāng)Aβ在腦組織中沉積超過(guò)一定的時(shí)間后，就可以造成神經(jīng)細(xì)胞的死亡、腦內(nèi)的炎癥性

5、反應(yīng)、以及其他的可以促進(jìn)AD病情進(jìn)展的有害的病理改變。而且，大量的研究顯示，Aβ在AD患者疾病的早期即出現(xiàn)。 小干擾RNA（siRNA）可謂是引起生物科學(xué)研究領(lǐng)域一場(chǎng)變革的工具，siRNA是一種特異性抑制特定基因的有力手段。RNAi不但可以用來(lái)快速的判斷基因的功能，而且目前已經(jīng)在病毒感染、腫瘤和遺傳性疾病中進(jìn)行了大量的研究，并取得了良好的效果。 減少Aβ的生成成為治療AD的主要靶位點(diǎn)。目前唯一得到FAD許可的治療藥物只有

6、乙酰膽堿酯酶抑制劑（如tacrine，donepezil，rivastigmine，galantamine），而其他的藥物治療正在研究進(jìn)行中，這些包括：?jiǎn)伟费趸敢种苿ㄈ鐂elegiline），抗氧化劑（如Vit E、C），雌激素替代療法和抗炎制劑（如非甾體類抗炎藥物），大多數(shù)的治療均為姑息性治療，而非預(yù)防或治愈性手段。目前減少Aβ產(chǎn)生的有許多方法，在本實(shí)驗(yàn)中我們選擇了抑制BACE1基因作為研究的靶基因，通過(guò)抑制此該基因的表達(dá)來(lái)減少A

7、β的生成。我們利用干擾技術(shù)應(yīng)用siRNA對(duì)BACE1基因進(jìn)行干擾抑制，觀察BACE1基因在SK-N-SH細(xì)胞株中的表達(dá)的改變，以及Aβ產(chǎn)生的改變情況。 研究目的: 1、利用siRNA干擾技術(shù)，采用化學(xué)合成的siRNA干擾或封閉BACE1基因，觀察BACE1的表達(dá)改變。 2、進(jìn)一步觀察BACE1基因的表達(dá)下降后，對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞Aβ產(chǎn)生的影響。 實(shí)驗(yàn)方法: 1、人類的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SK-N-S

8、H細(xì)胞正常情況下，表達(dá)APP和BACE1，我們利用SK-N-SH細(xì)胞作為體外研究的細(xì)胞系。 2、我們利用Ambion公司的Silencer（）pre-designed siRAN Specification system設(shè)計(jì)合成了3對(duì)BACE1基因雙鏈siRNA。3對(duì)siRNAs特異性的針對(duì)BACE1基因。 3、利用Ambion公司的siPORT NeoFX轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染siRNA入SK-N-SH細(xì)胞。為比較、觀察siRN

9、A對(duì)BACE1基因的干擾作用，分別使用了10uM-50uM濃度不等的siRNA轉(zhuǎn)染SK-N-SH細(xì)胞，并且分別從12-48小時(shí)搜集細(xì)胞，進(jìn)行檢測(cè)。 4、應(yīng)用RT-PCR在的mRNA水平上檢測(cè)BACE1基因的表達(dá)。 5、應(yīng)用Western blot方法，檢測(cè)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的神經(jīng)細(xì)胞的BACE1蛋白表達(dá)。 6、應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)分

10、泌到細(xì)胞外的Aβ42的量。轉(zhuǎn)染后6小時(shí)將siPORT NeoFX轉(zhuǎn)染試劑換成MEM細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)SK-N-SH細(xì)胞，并且每6-12小時(shí)收集培養(yǎng)液上清用于檢測(cè)Aβ42。 結(jié)果: 1、設(shè)計(jì)合成特異性的siRNAs 我們利用Ambion公司的Silencer（）pre-designed siRAN Specification system設(shè)計(jì)合成了3對(duì)BACE1基因雙鏈siRNA。3對(duì)siRNAs特異性的針對(duì)BAC

11、E1基因。 2、siRNA轉(zhuǎn)染SK-N-SH細(xì)胞株傳代細(xì)胞： 通過(guò)對(duì)3對(duì)siRNA1、siRNA2、siRNA3從不同的工作濃度和不同的轉(zhuǎn)染后時(shí)間進(jìn)行了觀察，我們發(fā)現(xiàn)40nM和50nM時(shí)轉(zhuǎn)染效率比較高，而且siRNA1和siRNA2對(duì)BACE1基因的抑制效應(yīng)比較好。36小時(shí)和48小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)siRNA的封閉效果比較好。 3、RT-PCR結(jié)果： 經(jīng)過(guò)對(duì)同一標(biāo)本的β-actin的產(chǎn)物積分光密度校正目的基因的積

12、分光密度值，并按公式相對(duì)值=目的基因表達(dá)強(qiáng)度/β-actin表達(dá)強(qiáng)度，計(jì)算出目的基因表達(dá)的相對(duì)值，我們可以看出siRNA對(duì)BACE1基因的封閉效應(yīng)達(dá)到了50％以上，實(shí)驗(yàn)組SK-N-SH細(xì)胞的基因抑制效果與對(duì)照組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著性差異。 4、Western blot雜交結(jié)果： 利用NIH成像系統(tǒng)對(duì)Western blot成像的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行量化分析，并與β-actin相比較，β-secretase酶的表達(dá)有明顯的下降，

13、與對(duì)照組比較有顯著性差異。 5、ELISA方法檢測(cè)結(jié)果： ELISA檢測(cè)顯示，處理以siRNA1、siRNA2的SK-N-SH細(xì)胞分泌到細(xì)胞外的Aβ42較對(duì)照組有明顯的減少。但是siRNA3干擾組的細(xì)胞所產(chǎn)生的Aβ42雖然也有減少，但是與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異。 結(jié)論: 1，利用siRNA干擾技術(shù)可以有效地干預(yù)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)源性的BACE1表達(dá)下降，此種抑制作用表現(xiàn)在mRNA和蛋白水平。 2、SK-

14、N-SH細(xì)胞內(nèi)的BACE1基因表達(dá)的降低，直接導(dǎo)致了細(xì)胞產(chǎn)生并分泌到細(xì)胞外Aβ42減少。 改變BACE1基因的表達(dá)，可以有效的抑制Aβ42的產(chǎn)生，BACE1基因可以作為AD治療的靶基因。 意義: Aβ的過(guò)度生成以及在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的沉積，是AD患者腦內(nèi)的特征性的病理改變，也是促進(jìn)AD疾病發(fā)展的關(guān)鍵因素。因此本研究的意義所在： siRNA可以在體外可以干預(yù)BACE1表達(dá)，β-secretase酶的活性的降低