Colivelin拮抗淀粉樣β蛋白所致大鼠記憶損傷的神經(jīng)保護作用研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為進行性認知功能障礙、學(xué)習(xí)和記憶能力喪失、智力下降，晚期出現(xiàn)嚴重癡呆。目前，全世界約有3600萬AD患者，據(jù)ADI估計這個數(shù)字以每20年翻一倍的速度增長，到2030年將會達到6600萬人。我國AD患者目前超過500萬，并且隨著人口老齡化速度和程度的加劇，我國AD的發(fā)病率和患者總數(shù)還將持續(xù)增加。毫無疑問，AD已成為21世紀威脅人類

2、的最嚴重疾病之一，是繼心血管疾病、腦血管疾病和癌癥之后嚴重影響老年人身體健康和人類壽命的“第四大殺手”。
　　 AD典型病理特征之一是腦內(nèi)出現(xiàn)高密度的老年斑。研究表明，老年斑的主要成分是由39-43個氨基酸組成的淀粉樣β蛋白(Amyloid β-protein，Aβ)。全長Aβ片段的神經(jīng)毒性作用已有廣泛報道，在此基礎(chǔ)之上，有大量實驗表明Aβ25-35是全長Aβ分子中一個較短的活性片段。本研究室在以往的研究中也發(fā)現(xiàn)，Aβ25-35

3、能在細胞培養(yǎng)、離體膜片鉗和在體電生理實驗中表現(xiàn)出與全長Aβ類似的神經(jīng)毒性作用。這些研究提示，拮抗Aβ神經(jīng)毒性作用可能是治療AD的一個有效手段。然而，迄今為止針對Aβ的AD治療尤其是有效拮抗Aβ神經(jīng)毒性作用的藥物研究，仍然沒有突破性進展。
　　 Humanin(HN)是日本學(xué)者于2001年首次發(fā)現(xiàn)的一個由24個氨基酸組成的線性多肽，能夠特異性抑制AD及其各種相關(guān)損傷引起的神經(jīng)元細胞死亡。Colivelin是由日本學(xué)者于2005年首

4、次報道的一種新的、由26個氨基酸組成的HN衍生物。目前有部分研究顯示，Colivelin有很強的神經(jīng)保護作用，能夠有效逆轉(zhuǎn)Aβ在原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元和行為學(xué)實驗中表現(xiàn)出的神經(jīng)毒性。然而，對于Colivelin在整體動物中的作用，尤其是對學(xué)習(xí)記憶的電生理模型長時程增強（long-term potentiation，LTP）的影響及Colivelin保護作用的機制的研究還處于起步階段。
　　 Morris水迷宮(Morris wate

5、r maze，MWM)是用來衡量動物學(xué)習(xí)記憶功能的經(jīng)典的行為學(xué)實驗手段，能夠有效反映動物的認知功能改變，因而被廣泛應(yīng)用于動物學(xué)習(xí)記憶功能包括AD動物行為學(xué)測試研究。長時程增強(long term potentiation，LTP)是由高頻刺激(high-frequency stimulus，HFS)所引發(fā)的一種興奮性突觸傳遞效能長時間持續(xù)增強的現(xiàn)象。鑒于海馬是AD發(fā)病過程中最早和最易受累的腦區(qū)之一，且海馬LTP的傷害與動物認知缺損高度相

6、關(guān)，海馬LTP特別是在體LTP已被視為研究學(xué)習(xí)記憶和AD發(fā)病機制的一個重要的電生理細胞模型而受到普遍關(guān)注。
　　 因此，本實驗采用海馬內(nèi)分別給予Aβ25-35、生理鹽水、Colivelin(0.2nmol)和Colivelin(0.2pmol、2pmol、0.2nmol)+Aβ25-35的方法，觀察了Colivelin對大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響，并探討其對于Aβ25-35導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶功能損傷的逆轉(zhuǎn)作用。實驗研究分為以下兩部分：(1)

7、利用國際公認的經(jīng)典的Morris水迷宮測試手段，觀察Colivelin預(yù)處理是否能有效拮抗大鼠Aβ所致的學(xué)習(xí)記憶傷害；(2)利用在體海馬LTP記錄手段，觀察海馬內(nèi)注射Colivelin預(yù)處理對于Aβ25-35引起的LTP壓抑的作用，進一步闡明Colivelin神經(jīng)保護作用的突觸前、后機制。通過以上兩部分研究，為Colivelin參與神經(jīng)系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)提供充分的實驗證據(jù)，從而為保護神經(jīng)元免受Aβ神經(jīng)毒性傷害，為預(yù)防和治療AD提供新的思路和理

8、論依據(jù)。
　　 第一部分：Colivelin部分逆轉(zhuǎn)Aβ25-35引起的大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能損害
　　 目的：
　　 利用Morris水迷宮測定大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能，觀察海馬內(nèi)給予Aβ25-35、生理鹽水、Colivelin以及合用Colivelin和Aβ25-35后大鼠在Morris水迷宮中的行為學(xué)表現(xiàn)，探討Colivelin預(yù)處理對Aβ引起的空間學(xué)習(xí)記憶功能損傷可能的作用。
　　 方法：
　　

9、 取運動靈活、無視力障礙的成年雄性SD大鼠(200-230g)隨機分組，進行Morris水迷宮定位航行和空間探索實驗，分別測定大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。主要指標包括大鼠尋找平臺的平均逃避潛伏期和游泳距離、撤離平臺后大鼠在目標象限游泳時間（限定時間為：120秒）和距離。同時，測定各組大鼠的游泳速度及大鼠的視力，以排除運動能力與視力障礙對測定指標的影響。各種藥物均經(jīng)海馬內(nèi)注射給予，恢復(fù)2-3周后進行實驗。
　　 結(jié)果：
　　

10、 (1)對照組大鼠學(xué)習(xí)記憶功能正常。逃避潛伏期在訓(xùn)練第1-5天內(nèi)分別為79.0±3.3s,36.6±3.0s，20.2±2.0s，19.9±1.3s和16.5±1.7s；大鼠找到平臺所游過的距離分別為1427.5±135.1cm，689.4±80.8cm,369.2±50.7cm,322.4±40.6cm和265.3±44.0cm;撤除平臺后大鼠在目標象限游泳所用時間和距離分別為55.4±3.Os和1150.4±63.9cm。
　

11、　 (2)海馬內(nèi)注射4nmolAβ25-35后顯著降低了大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。Aβ25-35海馬內(nèi)注射組大鼠的平均潛伏期和游過距離在第1天與對照組沒有明顯差別，在第2-5天分別為52.8±4.3s,39.5±1.6s，29.3±2.6s，26.8±1.4s和899.1±108.9cm,551.7±54.9cm,448.5±68.7cm,369.6±28.6cm，與對照組相比，其平均潛伏期明顯延長，游過距離明顯縮短（P<0.01或P

12、<0.05）；撤除平臺后大鼠在目標象限游泳所占時間和距離顯著縮短，分別為36.8±2.9s和756.9±52.9cm（P<0.01）。
　　 (3)海馬內(nèi)單獨注射0.2nmol Colivelin后，大鼠的學(xué)習(xí)、記憶功能與對照組相比均未受到影響(P＞0.01)，分別為35.3±4.4s，22.1±2.9s,21.4±2.6s,19.4±0.7s和670.0±90.6cm,398.3±80.9cm,357.2±51.5cm,260

13、.0±37.0cm，撤掉平臺后在目標象限游泳所用的時間和距離為55.0±3.0s和1148±63.1cm，與對照組相比無明顯差別(P＞0.01)。但聯(lián)合給予Colivelin(0.2pmol，2pmol，02nmol)與Aβ25-35后，與Aβ25-35組相比，各組平均潛伏期和游過距離兩個指標在第2-5天都有縮短現(xiàn)象，0.2pmol Colivelin+Aβ25-35組(n=11)2-5天找到平臺所用的時間和距離分別為45.4±3.5s

14、,33.9±1.7s,24.6±3.8s,22.3±1.9s和728.0±78.3cm,425.1±43.8cm,339.9±84.4cm，286.1±41.5cm;在2pmol Colivelin+Aβ25-35組(n=12)分別為33.8±3.8s，29.8±2.1s,22.0±1.6s,20.0±1.6s和582.1±115.2cm,385.6±59.1cm,281.5±33.3cm,228.8±27.3cm;在0.2nmol C

15、olivelin+Aβ25-35組(n=12)，分別為28.1±2.4s，20.8±2.1s，19.3±1.6s,17.9±2.4s和509.5±63.6cm,302.9±56.7cm,247.9±28.8cm,203.8±47.9cm與Aβ25-35組相比均有明顯縮短(P<0.01)，并且這種逆轉(zhuǎn)作用具有劑量依賴性。撤除平臺后大鼠在目標象限游泳所用時間和距離實驗中，0.2pmol Colivelin+Aβ25-35組為39.1±2.1

16、s和799.0±74.0cm;2pmol Colivelin+Aβ25-35組為43.8±3.0s和934.9±53.8cm;0.2nmol Colivelin+Aβ25-35組為54.0±3.7s和1148.4±63.0cm，與Aβ25-35組相比均有并不同程度的增加，并且這種增加呈現(xiàn)出劑量依賴性。
　　 (4)各實驗組動物在可視平臺實驗中的逃避潛伏期和游泳速度均無顯著區(qū)別。
　　 結(jié)論：
　　 海馬內(nèi)注射Aβ

17、25-35能夠傷害大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力，單獨使用Colivelin不會對大鼠的學(xué)習(xí)和記憶活動造成影響，但Colivelin預(yù)處理之后給予Aβ25-35，發(fā)現(xiàn)Colivelin可部分逆轉(zhuǎn)Aβ對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的損傷作用，并且此逆轉(zhuǎn)作用具有劑量依賴性。
　　 第二部分：Colivelin拮抗Aβ25-35引起的大鼠在體海馬LTP損害
　　 目的：
　　 通過海馬內(nèi)注射Colivelin以及Aβ25-35后記錄海

18、馬場興奮性突觸后電位（field excitatory postsynaptic potentials，fEPSPs）和長時程增強(LTP)，研究不同劑量Colivelin預(yù)處理之后對Aβ25-35壓抑大鼠海馬CA1區(qū)在體LTP的逆轉(zhuǎn)作用及其可能機制。
　　 方法：
　　 采用海馬內(nèi)注射給藥后已行水迷宮測試的SD大鼠，麻醉后將其固定在腦立體定位儀上，將綁定好的刺激電極和記錄電極精確插入到海馬刺激和記錄部位。通過給予海馬S

19、chaffer側(cè)枝單個電刺激、強直電刺激和雙脈沖刺激，在海馬CA1區(qū)放射層誘發(fā)和記錄基礎(chǔ)的fEPSPs、強直刺激引起的LTP，以及配對脈沖引起的雙脈沖易化(paired pulse facilitation,PPF).
　　 結(jié)果：
　　 (1)Aβ25-35不影響基礎(chǔ)性突觸傳遞，但對于高頻刺激引起的LTP具有明顯的壓抑作用。給予HFS后0min,30min，60min，對照組fEPSPs幅度增強至176.8±4.1％，

20、150.6±2.8％和141.3±2.3%;4nmol Ap25-35組的fEPSPs幅度分別只有166.6±3.0%，116.2±1.6和106.2±2.8%;表明Aβ25-35片段可明顯壓抑海馬CA1區(qū)LTP(P<0.01)。
　　 (2)單獨給予0.2nmol Colivelin后，基礎(chǔ)性突觸傳遞和LTP都沒有發(fā)生明顯改變。其在給予HFS后0min,30min，60min時分別為：178.5±2.9%，139.9±2.9%

21、，138.5±2.1%。給予Colivelin(0.2pmol，2pmol,0.2nmol)預(yù)處理后，再給予Aβ25-35，在0.2pmol Colivelin+Aβ25-35組，其數(shù)值分為為：164.5±1.8％，122.4±1.9%，110.3±1.1%；在2pmol Colivelin+Aβ25-35組中，數(shù)值分別為：166.0±2.3%，132.2±2.1%，119.2±1.2%;在0.2nmol Colivelin+Aβ25-

22、35組中則分別為：178.7±2.8%，139.8±2.4%，126.0±2.6%。LTP值在HFS后0min,30min和60min時的數(shù)值均高于單獨給予Aβ25-35LTP(P<0.01)，并且差別具有劑量依賴性。表明Colivelin能夠劑量依賴性的逆轉(zhuǎn)AD對LTP的傷害作用。
　　 (3)對照組和各實驗組的PPF都沒有顯著差異，提示所用各種藥物影響LTP主要不是通過突觸前機制實現(xiàn)的。
　　 結(jié)論：