α-淀粉酶的分子定向進(jìn)化及其突變體結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、近年來，定向進(jìn)化技術(shù)的迅猛發(fā)展，給基因工程帶來新的革命，由于其中最重要的一步必須有極大多樣性的突變體庫的建立，使核苷酸類似物這一研究工具在這一新生領(lǐng)域中又發(fā)揮了不可缺少的重要作用。本課題從核苷酸類似物這一獨(dú)特的視角出發(fā)，首次應(yīng)用核苷酸類似物5-BrdUTP 作為PCR 體外隨機(jī)突變的誘變劑的方法，在原有的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對核苷酸類似物5-BrdUTP 的突變機(jī)理進(jìn)行了進(jìn)一步的探討和研究。5-BrdUTP 在體外可以代替Dttp，并可低效率的

2、代替Dctp，與腺嘌呤和鳥嘌呤的錯(cuò)配，造成突變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5-BrdUTP 可以產(chǎn)生12 種可能的單堿基替換突變類型中的8 種(A:T, A:G, A:C, T:C, G:A, G:C, C:A, C:T)。包括4 種轉(zhuǎn)換類型和4種顛換類型。主要突變類型為A:T→G:C (72.9％)。同時(shí)還包括堿基插入和缺失突變類型，其中還包括大片段的缺失。 本文報(bào)道的關(guān)于5-BrdUTP 致突變的新結(jié)論主要為以下幾點(diǎn)：(1) 以野油菜

3、黃單胞菌(Xanthomonas campestris) 野生型淀粉酶基因?yàn)槟０宓捏w外突變中存在突變熱點(diǎn)；(2) 突變頻率可以通過改變5-BrdUTP 加入PCR 反應(yīng)體系中的濃度來控制；(3)5-BrdUTP 突變譜有一定的偏倚性，但產(chǎn)生的突變類型多樣，其中即包括轉(zhuǎn)換，也包括顛換。因此本誘變方法是一種有效的構(gòu)建多樣性的突變體庫的方法。 從上述方法構(gòu)建的α-淀粉酶基因突變體庫中篩選到一個(gè)截短突變體酶Xa-S2。從Xa-S2 基

4、因DNA序列推導(dǎo)的氨基酸序列有167 個(gè)殘基，只有野生型α-淀粉酶Xa-WT（475 個(gè)殘基）大小的35％，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果顯示Xa-S2 無法折疊成完整的(β/α)8桶狀催化結(jié)構(gòu)域，并且失去了野生型淀粉酶的3 個(gè)催化活性位點(diǎn)，但仍然具有淀粉酶的水解活性。將Xa-S2 和野生型淀粉酶基因分別構(gòu)建到大腸桿菌表達(dá)載體pET30a(+)，得到重組質(zhì)粒Pxas2 和Pxawt，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21(DE3)，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，得到純化

5、的Xa-S2 和Xa-WT蛋白后，對兩個(gè)酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明Xa-S2 的Km值為32 mg/Ml，最適Ph為6.2，最適反應(yīng)溫度為30℃。 而野生型酶Xa-WT的Km值為8 mg/Ml，最適反應(yīng)Ph范圍為5.9~6.2，最適溫度范圍為45~50℃。高效液相色譜(HPLC)分析其對淀粉的最終水解產(chǎn)物類型均包含葡萄糖和麥芽糖，并以葡萄糖為主。但Xa-S2 與Xa-WT相比，在保留時(shí)間為8.0min位置多出一個(gè)產(chǎn)物峰。

6、預(yù)示著兩種酶作用于底物的方式有所不同。二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果表明，野生型淀粉酶具有完整、典型的淀粉酶13 家族的(β/α)8桶狀催化結(jié)構(gòu)域，3 個(gè)催化殘基和4 個(gè)典型保守區(qū)域，而Xa-S2 只包含桶狀結(jié)構(gòu)的部分結(jié)構(gòu)單元，即N-端的βαβαβ單元。因此，Xa-S2 為首次發(fā)現(xiàn)的只包含小于半桶狀結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)單元組成的有酶活性的蛋白，這對于(β/α)8桶狀結(jié)構(gòu)家族的結(jié)構(gòu)與進(jìn)化關(guān)系的研究意義重大。 將黑曲霉(Aspergillus

7、 niger)葡萄糖淀粉酶GA-I 的SBD 結(jié)構(gòu)域序列與野生型淀粉酶基因用PCR 的方法融合，得到融合酶基因XAGsbd，構(gòu)建到畢赤酵母表達(dá)載體Ppic9k，得到重組質(zhì)粒pPICXAGsbd，轉(zhuǎn)化畢赤酵母(Pichia pastoris) GS115 后，獲得了整合型分泌表達(dá)α-淀粉酶的重組菌株GS115(XAGsbd)，對獲得的融合蛋白進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究和生淀粉水解能力的研究結(jié)果表明，其最適反應(yīng)條件分別為Ph5.9~6.2和45~50

8、℃，水解生淀粉的速率可以最高達(dá)到21％ (30h)。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析結(jié)果表明融合蛋白被高度糖基化。用生淀粉吸附的純化方法純化后，并用2％ β-環(huán)糊精溶液洗脫可得到純化的蛋白。 將一個(gè)編碼的淀粉酶活性提高的突變基因，克隆到由Rdna序列介導(dǎo)的酵母整合型表達(dá)載體Phbm368上，得到重組質(zhì)粒Phbm368xa，轉(zhuǎn)化釀酒酵母Saccharomycescerevisiae INVScI后，獲得了整合型