耐熱堿性磷酸酶分子突變體的結(jié)構(gòu)與功能變化.pdf

1、堿性磷酸酯酶(Alkaline Phosphatase，簡(jiǎn)稱(chēng)AP，EC3.1.3.1)是一種磷酸單酯酶，可作為工具酶以及同位素標(biāo)記應(yīng)用于分子生物學(xué)各項(xiàng)研究。近年來(lái)，一類(lèi)能夠在極度高溫環(huán)境下生存的生物引起了國(guó)內(nèi)外科學(xué)家們的關(guān)注，研究者們發(fā)現(xiàn)，這些生物的酶具有特有的結(jié)構(gòu)和功能，即很高的耐熱性和70℃以上的最適反應(yīng)溫度，有些酶在110℃甚至更高的溫度都有活性。高度的耐熱性以及較高的最適反應(yīng)溫度使得這些酶類(lèi)成為研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系以及蛋白質(zhì)

2、耐熱機(jī)制的極好的模型材料。 本實(shí)驗(yàn)采用亞硝基胍和PCR誘變法獲得了200余個(gè)耐熱堿性磷酸酯酶基因的隨機(jī)突變體。我們對(duì)其中八個(gè)突變體進(jìn)行了核苷酸序列的測(cè)定和突變體基因的原核表達(dá)、表達(dá)產(chǎn)物的分離純化、表達(dá)產(chǎn)物的酶活、最適反應(yīng)溫度、熱穩(wěn)定性等指標(biāo)的測(cè)定；并將所得到的TAP全序列提交到丹麥技術(shù)大學(xué)(Technical Universitv of Denmark)CBS中心的CPHmodels服務(wù)器(http：／／www.cbs.dt

3、u.dk／services／CPHmodels／)進(jìn)行高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，在獲得了與突變體具有最大相容性的已知結(jié)構(gòu)的大腸桿菌堿性磷酸酶(BAP)的一個(gè)突變體(D153hd330n)A鏈的高級(jí)結(jié)構(gòu)之后，采用分子模擬的方法模擬出突變體酶蛋白前319肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)，同時(shí)使用SWISS-PORT的Swiss-PDBviewer軟件對(duì)TAP突變體進(jìn)行了二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，分析了引起耐熱性變化的機(jī)理。取得的主要研究結(jié)果如下： 1)8個(gè)突變體的突變情況

4、：3號(hào)突變體核苷酸CCC→CUC<'1271> 氨基酸P→L<'424>5號(hào)突變體核苷酸CGG→CGA<'663> GUG→AUG<'1093> 氨基酸V→M<'365>25號(hào)突變體核苷酸CUC→CUU<'221> ACG→AUG<'323> 氨基酸T→M<'108>35號(hào)突變體核苷酸CCC→CUC<'1271> CUG→GGG<'1340> 氨基酸P→L<'424> L→G<'447>52號(hào)突變體核苷酸ACC→AUC<'419>氨基酸

5、T→I<'140>所有突變體核苷酸AGC→AAC<'299>，氨基酸N→S<'100>2)8個(gè)突變體的最適反應(yīng)溫度：3、6、9、48號(hào)突變體的最適反應(yīng)溫度有所下降，而5、35、52號(hào)基本不變；25號(hào)略有上升。但所有突變體的最適反應(yīng)溫度都在70℃左右的小范圍內(nèi)變化。8個(gè)突變體的酶活力：幾乎所有突變體在70℃時(shí)都表現(xiàn)出了最大酶活力；同樣條件下誘導(dǎo)表達(dá)，25號(hào)和35號(hào)突變體的蛋白表達(dá)較其它突變體稍低。8個(gè)突變體酶的熱穩(wěn)定性：25號(hào)和35號(hào)熱穩(wěn)

6、定性有所上升； 5號(hào)、6號(hào)、9號(hào)、48號(hào)熱穩(wěn)定性有所 下降；而3號(hào)和52號(hào)熱穩(wěn)定性幾乎不變。3)突變體高級(jí)結(jié)構(gòu)模擬：Asn→Ser<'100>形成α螺旋的能力都比較弱，兩者的疏水性也相似，這一突變對(duì)蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象并無(wú)太大影響，僅僅是突變位點(diǎn)周?chē)鷼滏I發(fā)生少量改變，因此可以認(rèn)為這個(gè)突變對(duì)耐熱性和熱穩(wěn)定性的影響不大。親水的Thr<'108>突變成非極性的Met，導(dǎo)致與該位點(diǎn)空間相鄰的N<'116>親水氨基酸His的極性殘基——咪

7、唑環(huán)產(chǎn)生空間電位排斥，從而造成His所在的β折疊構(gòu)象發(fā)生改變。由于該構(gòu)象的改變?cè)诳臻g上距離酶的活性中心較接近，因此，該突變體酶的耐熱性和熱穩(wěn)定性產(chǎn)生較為明顯的變化。極性親水的Thr被另一個(gè)非極性疏水的Ile所取代，在高級(jí)結(jié)構(gòu)作用力上也僅僅是一個(gè)氫鍵發(fā)生改變，同時(shí)該位點(diǎn)也遠(yuǎn)離酶的活性中心，因此，該突變對(duì)酶的活性、穩(wěn)定性和耐熱性的影響不大。 本研究得出的初步結(jié)論或推論如下： 1)經(jīng)過(guò)亞硝基胍和PCR誘變法獲得的一系列突變

8、體在核苷酸基礎(chǔ)上只發(fā)生了點(diǎn)突變，由此導(dǎo)致其蛋白質(zhì)的序列也只是發(fā)生了個(gè)別氨基酸的突變。氨基酸頻率分析顯示出蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)僅在個(gè)別位點(diǎn)上稍有變化，說(shuō)明突變只是發(fā)生了轉(zhuǎn)換或顛換而不是插入突變或缺失突變。 2)根據(jù)TAP在發(fā)生突變之后，表現(xiàn)出的最適反應(yīng)溫度、酶活性、以及熱穩(wěn)定性的變化可以推測(cè)，酶的耐熱性變化的程度和氨基酸替換發(fā)生的部位有關(guān)，非活性部位的替換通常只涉及最高耐受溫度的變化。遠(yuǎn)離活性中心的個(gè)別位置的點(diǎn)突變對(duì)酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)和酶

9、的耐熱性沒(méi)有顯著影響。個(gè)別或少數(shù)氨基酸的替換一般只能引起酶高級(jí)結(jié)構(gòu)的局部和細(xì)微的改變，之所以出現(xiàn)這種情況，是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)是靠所有氨基酸殘基的各種弱鍵作用來(lái)維持的，每個(gè)氨基酸的貢獻(xiàn)都很有限，少數(shù)氨基酸變異所引起的弱鍵數(shù)量和能量的改變不足以對(duì)整個(gè)高級(jí)結(jié)構(gòu)的根基造成動(dòng)搖，這與蛋白質(zhì)進(jìn)化的總趨勢(shì)是相符的。 3)推測(cè)編碼序列(G+C)％的提高有助于耐熱性的提高。從密碼子偏好性分析，我們可以看出除了終止密碼子以外，使用相對(duì)頻率(R