耐熱堿性磷酸酶功能結(jié)構(gòu)域的進(jìn)一步定位

1、ISSN100727626CN1123870ΠQ中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)ChineseJournalofBiochemistryMolecularBiology2004年2月20(1):89～94耐熱堿性磷酸酶功能結(jié)構(gòu)域的進(jìn)一步定位郁鋒許曉風(fēng)3(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院南京210097)摘要為了進(jìn)一步精確定位耐熱堿性磷酸酶(TAP)的功能結(jié)構(gòu)域和建立酶功能結(jié)構(gòu)域定位的有效方法在對(duì)TAP進(jìn)行序列相容性比對(duì)及二級(jí)結(jié)構(gòu)統(tǒng)計(jì)預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)上以二級(jí)

2、結(jié)構(gòu)單元的完整性為依據(jù)對(duì)其功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行定位.TAP的功能結(jié)構(gòu)域在35～476氨基酸之間記為TAPN34C25(TAP的N端去掉34個(gè)氨基酸而C端去掉25個(gè)氨基酸)比盛小禹等定位的少15個(gè)氨基酸.克隆、表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了TAPN34C25的酶學(xué)活性其最適反應(yīng)溫度為72℃比TAPND27(N端去除了27個(gè)信號(hào)肽氨基酸的TAP)上升了7℃而最高耐受溫度為83℃比TAPND27下降了16℃.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明以二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行酶功能結(jié)構(gòu)域定位是

3、一種更為精確的方法.關(guān)鍵詞耐熱堿性磷酸酶功能結(jié)構(gòu)域序列相容性比對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)統(tǒng)計(jì)預(yù)測(cè)中圖分類號(hào)Q71FurtherLocationoftheFunctionalDomainonThermostableAlkalinePhosphataseYUFengXUXiao2feng3(CollegeofLifeSciencesNanjingNmalUniversityNanjing210097China)AbstractTolocatethefunc

4、tionaldomainofthethermostablealkalinephosphatase(TAP)mepreciselytoexpleanewefficientlocationmethodthesecondarystructurewaspredictedonwkProteinSequenceAnalysis(NPS@)serveritsfunctionaldomainwasdeterminedasTAPN34C25(with34

5、aminoacidsdatNterminal25atCterminal)accdingtotheintactnessofitstwoterminalsecondarystructures.TAPN34C25was15aminoacidresiduesshterthanthefunctionaldomainTAPND27determinedbyShengXiao2yuetal.Thecloningexpressionhaveprovedt

6、hatTAPN34C25didpossesstheexpectedenzymaticactivity.Itsoptimalreactiontemperaturewas72℃with7℃higherthanTAPND27itshighesttolerabletemperature83℃with16℃lowerthanTAPND27.AmeexactTAP’sfunctionaldomainwasobtained.Theresultssho

7、wedthattwoterminalsecondarystructure2determinedmethodwasameefficientfthefunctionaldomainlocationofthethermostableenzyme.Keywdsthermostablealkalinephosphatasefunctionaldomainsequencecompatiblealignmentsecondarystructureco

8、nsensusprediction收稿日期:2003202219接受日期:20032052063聯(lián)系人:Tel:02523598388E2mail:xxf@jlonline.com郁鋒男1977年生碩士Received:February192003Accepted:May620033Crespondingauth:Tel:(025)3598388E2mail:xxf@jlonline.com自從1972年發(fā)現(xiàn)第一株嗜熱菌以來(lái)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和分

9、離到了70多種耐熱的古細(xì)菌[1]闡明這些菌內(nèi)蛋白質(zhì)和酶的耐熱機(jī)理不僅有重要的理論意義而且有潛在的應(yīng)用價(jià)值.一般認(rèn)為酶的耐熱性和結(jié)構(gòu)折疊的致密性之間有很大的關(guān)系如三級(jí)結(jié)構(gòu)表面的離子對(duì)和兩端肽段在結(jié)構(gòu)中的錨定等[1].事實(shí)上通常在酶蛋白的N端和C端都存在一些對(duì)于發(fā)揮特定酶活性非必需的氨基酸序列.為了判斷酶兩端的氨基酸序列在酶的耐熱性中的作用我們可以使用缺失突變的方法去掉這些非功能區(qū)域比較這種改變對(duì)于酶功能和酶的耐熱性的影響從而揭示它們?cè)诿傅?/p>

10、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性中的作用.盛小禹等從棲熱菌Thermussp.FD3041中分離出一種胞內(nèi)酶———耐熱堿性磷酸酶(TAP)(由501個(gè)氨基酸組成野生型的最適反應(yīng)溫度在70℃以上屬典型的耐熱酶[2])并對(duì)耐熱堿性磷酸酶去除27Fig.1Sequencecompatiblealignmentof2ANHTAPTheactivesitesareunderlinedFig.2SecondarystructurepredictionofTAP’s50a

11、minoacidsatC2terminalh:α2helixe:β2sheetc:coilt:turn:undetermined以切除然后是一段卷曲區(qū)再后面是一個(gè)β折疊.考慮到β折疊的形成至少需要兩條也就是說(shuō)后面肯定會(huì)存在至少一個(gè)β折疊和它相互作用因此如果這個(gè)β折疊被破壞的話很可能引起功能區(qū)域構(gòu)象的較大改變從而影響酶的活性.事實(shí)上前人的工作也證明了這一點(diǎn)[3].當(dāng)切除41個(gè)氨基酸時(shí)(第41位是L該氨基酸已經(jīng)在β折疊區(qū)中)TAP就失去了活