堿性磷酸酶米氏常數(shù)的測(cè)定

1、堿性磷酸酶米氏常數(shù)的測(cè)定堿性磷酸酶米氏常數(shù)的測(cè)定【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹客ㄟ^堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，AKP）米氏常數(shù)的測(cè)定，了解其測(cè)定方法和意義。學(xué)會(huì)運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定酶的活性及觀察抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響，加深對(duì)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的理解?！緦?shí)驗(yàn)原理】本實(shí)驗(yàn)以磷酸苯二鈉為底物，由堿性磷酸酶催化水解，生成游離酚和磷酸鹽。酚在堿性條件下與4氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化，生成紅色的醌衍生物，顏色深淺和酚的含量成正比。根據(jù)吸光

2、值的大小可以計(jì)算出酶的活性，也可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查知酚的含量，進(jìn)而算出酶活性的大小?！緦?shí)驗(yàn)步驟】1.底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響(1)取6支試管，作好標(biāo)記。按下表操作：（未加抑制劑組未加抑制劑組）另取6支試管，做好標(biāo)記。按下表操作：（高精氨酸組高精氨酸組）管號(hào)管號(hào)試劑試劑mlml1234560.01molL0.01molL底物液底物液0.100.100.200.200.300.300.400.400.800.800.00.05mmolL5

3、mmolL高精氨酸溶液高精氨酸溶液0.100.100.100.100.100.100.100.100.100.100.100.10pH10.00.1pH10.00.1molmol碳酸鹽緩沖液碳酸鹽緩沖液0.700.700.700.700.700.700.700.700.700.700.700.70蒸餾水蒸餾水1.051.050.950.950.850.850.750.750.350.351.151.1537℃37℃水浴中保溫水浴中保溫5

4、分鐘分鐘AKPAKP酶液酶液0.100.100.100.100.100.100.100.100.100.100.100.10最終底物濃度最終底物濃度(mmolL)(mmolL)0.50.51.01.01.51.52.02.04.04.00.00.0(2)加入酶液(0.05μgml)后各管混勻并立即記錄時(shí)間將上述各管置37℃水浴中準(zhǔn)確保溫15分鐘。(3)保溫結(jié)束，立即加堿性溶液1.1ml終止反應(yīng)。(4)各管分別加入0.3%4氨基安替比林1

5、.0ml，0.5%鐵氰化鉀2.0ml，充分混勻，放置10分鐘，以6號(hào)空白管作對(duì)照，于510nm波長(zhǎng)處比色，根據(jù)酚標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活性。(5)以各管基質(zhì)濃度的倒數(shù)1[S]為橫坐標(biāo)，以各管吸光度值的倒數(shù)或者以酶活性單位的倒數(shù)為1V做橫坐標(biāo)，作圖求出Km值。管號(hào)管號(hào)試劑試劑mlml1234560.010.01molLmolL底物液底物液0.100.100.200.200.300.300.400.400.800.800.00.0pH10.0pH1

6、0.00.10.1molLmolL碳酸鹽緩沖液碳酸鹽緩沖液0.700.700.700.700.700.700.700.700.700.700.700.70蒸餾水蒸餾水1.101.101.001.000.900.900.800.800.400.401.201.2037℃37℃水浴中保溫水浴中保溫5分鐘分鐘AKPAKP酶液酶液0.100.100.100.100.100.100.100.100.100.100.100.10最終底物濃度最終底物

7、濃度(mmolL)(mmolL)0.50.51.01.01.51.52.02.04.04.00.00.00.000[Re30](0.000)0.000[Re4](0.000)0.000[Re30](0.000)0.000[Re1](0.000)0.000[Re3](0.000)0.000[Re5](0.000)0.000[Re7](0.000)Series1Linear(Series1)Linear(Series1)高精氨酸組濃度倒數(shù)1

8、S吸光度倒數(shù)1V得到擬合直線方程：y=3.4764x0.6688根據(jù)可得到：1=?11=10.6688=1.495，=3.4764=5.1983.酚標(biāo)準(zhǔn)曲線05101520253035404500.511.5Series1Linear(Series1)Linear(Series1)酚標(biāo)準(zhǔn)曲線酚含量(μg)吸光度分析：由上述圖表來看，在加入高精氨酸抑制酶活性后，酶的Km值增大，Vm值也增大【實(shí)驗(yàn)討論】1.在實(shí)驗(yàn)過程中，滴加試劑和反應(yīng)時(shí)間的