淀粉酶米氏常數(shù)測定(1)

1、淀粉酶米氏常數(shù)的測定,,生物化學實驗之八,安徽師范大學生科院生化教研室,一、 實驗目的,了解并掌握米氏常數(shù)的意義和測定方法,二、 實驗原理,酶促反應v-[S]曲線,推導出米氏方程為：,米氏常數(shù)Km是酶的一個基本特征常數(shù)，它包含著酶與底物結(jié)合和解離的性質(zhì)。特別是同一種酶能夠作用于幾種不同底物時，米氏常數(shù)Km往往可以反映出酶與各種底物的親和力的強弱。測定Km和Vm，可通過作圖法求得。 最常用的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法。這

2、個方法是將米氏方程轉(zhuǎn)化為倒數(shù)形式，即：,以1/v對1/[S]作圖，可得一條直線，所得直線的截距是1/Vm，斜率為Km/ Vm。通過Lineweaver-Burk作圖法作圖后可方便的求出Km值。,試管移液搶秒表吸耳球恒溫水浴鍋7200型分光光度計。,三 儀器和試劑,三 儀器和試劑,試劑 （1）酶液：精確稱取酶制劑0.1g(以大約2000 U／g計)，先用少量40℃蒸餾水溶解、浸提。將上層液小心傾入500ml容量瓶內(nèi)，沉淀再加水

3、搗研。如此重復，最后全部移入容量瓶中，定容后搖勻，用四層紗布過濾，濾液供測試定用 （2）原碘液 稱取碘11 g，碘化鉀(KI)22 g，先用少量蒸餾水使碘-碘化鉀完全溶解，定容至500 mL，貯于棕色瓶內(nèi)。（3）稀碘液 取原碘液2mL，加碘化鉀20 g，用蒸餾水定容至500 mL．貯于棕色瓶內(nèi)。（4）4％可溶性淀粉 精確稱取可溶性淀粉4.000g（精確至0.001g），用少量蒸餾水調(diào)勻。邊攪拌邊加入煮水70mL，加熱煮沸至透

4、明，冷卻后定容至100 mL, 此溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。,（5）0.02mLpH6.0磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液 稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H2O)45．23g和檸檬酸(C6H8O7·H2O)8.07g，用蒸餾水溶解，用酸度計或pH試紙校正pH，定容至1000 mI。 （6）0.2moL/L HCl 取36%鹽酸（飽和濃鹽酸）0.86ml加入已加有少量蒸餾水的50ml容量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻即可。,四、

5、實驗操作,1. 淀粉濃度梯度吸光度 不同底物濃度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）的可溶性淀粉4ml，加入緩沖液0.75ml和蒸餾水0.25ml，充分搖勻，60℃放置10min，立即加入3.0ml的0.2moL/L HCl終止反應，然后立即取出1.00ml溶液置于5.00ml稀碘液搖勻，顯色，并以稀碘液作對照，于660nm處測定吸光度（按操作表1操作）,,,不同底物(可溶性淀粉)濃度（0.5%、1.0%

6、、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）可溶性淀粉4mL，緩沖液0.75mL，搖勻后，在60℃水浴中平衡5 min，加入0.25 mL稀釋好的酶液，立即記時，充分搖勻，準確反應10 min，立即加入3.0ml的0.2moL/L HCl終止反應，然后立即取出1.00ml溶液置于5.00ml稀碘液顯色，搖勻，并以稀碘液作對照，于660nm處測定吸光度（按操作表2操作）。,2. Km測定,,,酶的反應速度V：以單位時間內(nèi)吸光度的減少量d(A