淀粉酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、班級(jí)：植物 092 ：徐煒佳 學(xué)號(hào)：0901080223淀粉酶活性的測(cè)定一、爭(zhēng)論背景及目的 一、爭(zhēng)論背景及目的酶是高效催化有機(jī)體陳代謝各步反響的活性蛋白，幾乎全部的生化反響都離不開酶 的催化，所以酶在生物體內(nèi)扮演著極其重要的角色，因此對(duì)酶的爭(zhēng)論有著格外重要的意義。酶的活力是酶的重要參數(shù)，反映的是酶的催化力量，因此測(cè)定酶活力是爭(zhēng)論酶的根底。酶活 力由酶活力單位表征，通過計(jì)算適宜條件下肯定時(shí)間內(nèi)肯定量的酶催化生成產(chǎn)物的量得到淀粉酶是水解淀

2、粉的糖苷鍵的一類酶的總稱，依據(jù)其水解淀粉的作用方式，可分為 α- 淀粉酶和β-淀粉酶等。α-淀粉酶和β-淀粉酶是其中最主要的兩種，存在于禾谷類的種子中。β-淀粉酶存在于休眠的種子中，而α-淀粉酶是在種子萌發(fā)過程中形成的。α-淀粉酶活性是衡量小麥穗發(fā)芽的一個(gè)生理指標(biāo),α-淀粉酶活性低的品種抗穗發(fā)芽,反之則易穗發(fā)芽。目前,關(guān)于 α-淀粉酶活性的測(cè)定方法很多種,活力單位的定義也各不一樣,國內(nèi)外測(cè)定 α-淀粉酶活性的方法常用的有凝膠集中法、3

3、,5-二硝基水楊酸比色法和降落值法 。這 3 種方法所用的材料分別是穎種子、萌動(dòng)種子和面粉,獲得的 α-淀粉酶活性應(yīng)當(dāng)分別是延遲(內(nèi)源)α-淀粉酶、萌動(dòng)種子 α-淀粉酶和后熟面粉的α-淀粉酶活性。DNS測(cè)定方法 優(yōu)點(diǎn)靈敏、準(zhǔn)確、準(zhǔn)確度高,適宜準(zhǔn)確測(cè)量小樣品 α-淀粉酶活性大小缺點(diǎn)測(cè)定步驟較繁 ,不便分析大量樣品,測(cè)定范圍較窄凝膠集中法降落值法簡(jiǎn)便、快速、省時(shí)、省力,消耗材料和藥品較少 ,不需要特別儀器,測(cè)定范圍較寬快速、省時(shí)、重現(xiàn)性好、

4、平行性好、消耗的藥品少,適宜于測(cè)量大量樣品邊界不清楚,靈敏度與準(zhǔn)確度較低,不適宜準(zhǔn)確測(cè)量 α-淀粉酶活性的大小消耗的材料多,間接測(cè)定 α-淀粉酶活性大小本試驗(yàn)的目的在于把握α-淀粉酶和β-淀粉酶的提取和測(cè)定方法。二、試驗(yàn)原理 二、試驗(yàn)原理萌發(fā)的種子中存在兩種淀粉酶，分別是α -淀粉酶和β-淀粉酶，β-淀粉酶不耐熱，在高溫下易鈍化，而α-下則發(fā)生鈍化。本試驗(yàn)的設(shè)計(jì)利用β-淀粉酶不耐熱的特性，在高溫下〔70℃〕下處理使得β-淀粉酶鈍化而測(cè)定

5、α-淀粉酶的酶活性。酶活性的測(cè)定是通過測(cè)定肯定量的酶在肯定時(shí)間內(nèi)催化得到的麥芽糖的量來實(shí)現(xiàn)的， 淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖，可用 3,5-二硝基水楊酸試劑測(cè)定，由于麥芽糖能將后者復(fù)原生成硝基氨基水楊酸的顯色基團(tuán)，將其顏色的深淺與糖的含量成正比，故可求出麥芽糖的含 量。常用單位時(shí)間內(nèi)生成麥芽糖的毫克數(shù)表示淀粉酶活性的大小。然后利用同樣的原理測(cè)得 兩種淀粉酶的總活性。試驗(yàn)中為了消退非酶促反響引起的麥芽糖的生成帶來的誤差，每組實(shí) 驗(yàn)都做了相應(yīng)

6、的比照試驗(yàn)，在最終計(jì)算酶的活性時(shí)以測(cè)量組的值減去比照組的值加以校正。在試驗(yàn)中要嚴(yán)格掌握溫度準(zhǔn)時(shí)間，以減小誤差。并且在酶的作用過程中，四支測(cè)定管及空白管不要混淆。麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液 0濃度 mg/ml OD520 工程 α(測(cè)) α(測(cè)) α(對(duì)) α(對(duì)) α + β α + β α + β α + β(測(cè)) (測(cè)) (對(duì)) (對(duì))OD520平行組數(shù)據(jù)均值 OD520 樣品麥芽糖濃度 mg/ml? ?入 1ml 稀釋后的酶液及 pH5.6 檸

7、檬酸緩沖液 1ml，以下步驟重復(fù)α-淀粉酶測(cè)定的第④及第⑤的操作。4. 麥芽糖的測(cè)定⑴標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取 15ml 具塞試管 7 支，編號(hào)，分別參加麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液〔1mg/ml)0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 毫升，用蒸餾水補(bǔ)充至1.0ml，搖勻后再參加 3，5-二硝基水楊酸 1ml，搖勻，沸水浴中準(zhǔn)確保溫 5min，取出冷卻，用蒸餾水稀釋至 15ml，搖勻后用分光光度計(jì)于520nm 波長(zhǎng)下比色，記錄消光值，以消光值為縱

8、坐標(biāo)，以麥芽糖含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。⑵樣品的測(cè)定取 15ml 具塞試管 8 支，編號(hào)，分別參加步驟 2 和 3 中各管的溶液各 1ml，再參加 3， 5-二硝基水楊酸 1ml，搖勻，沸水浴中準(zhǔn)確煮沸 5min，取出冷卻，用蒸餾水稀釋至 15ml， 搖勻后用分光光度計(jì)于 520nm 波長(zhǎng)下比色，記錄消光值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)展結(jié)果計(jì)算。五、數(shù)據(jù)整理及計(jì)算 五、數(shù)據(jù)整理及計(jì)算上表中前 4 行數(shù)據(jù)為試驗(yàn)的原始數(shù)據(jù)。以表中前兩行數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

9、〔見下頁〕，計(jì)算上表中第 4 行數(shù)據(jù)〔各樣品的OD 值〕均值，填入上第5 行中，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程，計(jì)算第 5 行 OD 值所對(duì)應(yīng)的麥芽糖濃度，填入最終一行，如上表。依據(jù)以上的數(shù)據(jù)整理的結(jié)果，結(jié)合以下公式計(jì)算兩種淀粉酶的活性：〔A－A”〕 ? 樣品稀釋總體積 ? ? 淀粉酶活性〔毫克麥芽糖· 克 ?1鮮重· 分鐘?1〕 ?樣品重〔g〕 ? 5〔B－B”〕 ? 樣品稀釋總體( ? ? ?)淀粉酶活性〔毫克麥芽糖? 克