實(shí)驗(yàn)土壤中產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選

1、生物制藥學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)1-5 產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選及誘變系列實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)需知,實(shí)驗(yàn)分組：2個(gè)實(shí)驗(yàn)室，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室分6組（名單上報(bào)），每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束留1組同學(xué)值日實(shí)驗(yàn)成績(jī)：占期末總成績(jī)的20%，包括實(shí)驗(yàn)出勤、實(shí)驗(yàn)操作、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及實(shí)驗(yàn)報(bào)告撰寫實(shí)驗(yàn)結(jié)束：將實(shí)驗(yàn)用品收拾整齊，由實(shí)驗(yàn)老師確認(rèn)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后方可離開實(shí)驗(yàn)報(bào)告：實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)步驟（注意事項(xiàng)）、實(shí)驗(yàn)結(jié)果、思考題,系列實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,實(shí)驗(yàn)1 土壤中產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選 （1、2）實(shí)驗(yàn)2 產(chǎn)

2、淀粉酶菌株的誘變劑量選擇 實(shí)驗(yàn)3 紫外誘變劑突變菌株的初篩 實(shí)驗(yàn)4 紫外誘變劑突變菌株的復(fù)篩 實(shí)驗(yàn)5 高產(chǎn)淀粉酶生產(chǎn)菌株的穩(wěn)定性及淀粉酶活力測(cè)定,背景知識(shí),淀粉酶（amylase, Amy, AMS ）：能水解淀粉、糖原和有關(guān)多糖中的O-葡萄糖鍵的酶 藥物：助消化藥，治療功能性消化不良,背景知識(shí),產(chǎn)淀粉酶微生物：細(xì)菌、真菌等菌種分離與篩選步驟： 采樣——培養(yǎng)——分離——篩選誘變育種步驟： 誘變——初篩—

3、—復(fù)篩——性能檢測(cè),背景知識(shí),實(shí)驗(yàn)1 土壤中產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選（1）,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握菌種分離與篩選的方法從土壤中篩選出能夠合成分泌淀粉酶的微生物,實(shí)驗(yàn)原理,自然界微生物種類繁多，有些微生物能夠以淀粉作為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，這是因?yàn)樗鼈兡軌蚝铣煞置诘矸勖?。?dāng)能合成淀粉酶的微生物在含有淀粉的固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，會(huì)將淀粉酶分泌到菌體周圍，使菌落周圍的淀粉水解成為小分子量的糊精、聚糖和單糖。這些水解產(chǎn)物不能與碘作用，從而在菌體周圍形成透明圈

4、。,實(shí)驗(yàn)步驟,1. 篩選培養(yǎng)基的配制（已完成）可溶性淀粉2 g，NaCl 5 g，牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，水1000 mL。 2. 倒平板（每組6個(gè)，每個(gè)平板10mL左右）,實(shí)驗(yàn)步驟,3. 土樣的采集各實(shí)驗(yàn)室分別取三種不同環(huán)境的土樣并記錄當(dāng)時(shí)取樣環(huán)境情況（1-2、3-4、5-6每?jī)尚〗M在同一個(gè)地方進(jìn)行取樣），通常取離地面5～15cm處的土壤。4. 稀釋分離取土樣1 g，加入9 mL無菌水，逐步稀釋至105、

5、106、107 （單數(shù)組）或106、107、108（雙數(shù)組） ，每個(gè)梯度涂2個(gè)平板。,,,,,,10ml,1g,,9ml,9ml,9ml,9ml,9ml,9ml,10-1,10-2,10-7,10-6,10-5,10-4,10-3,1ml,1ml,1ml,1ml,1ml,稀 釋,,1ml,分離,,,實(shí)驗(yàn)步驟,5.各組做好標(biāo)記，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h（倒置培養(yǎng)？？）6. 產(chǎn)淀粉酶菌株的鑒定（下次課）,6. 產(chǎn)淀粉酶菌株的鑒定,倒平

6、皿（注意培養(yǎng)基狀態(tài)、體積、表面平整）：3個(gè)用接種環(huán)挑取單菌落到無菌瓶皿上（點(diǎn)植法：用接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面接觸幾點(diǎn)），同時(shí)用簽字筆按對(duì)應(yīng)順序?qū)Ω鲉尉溥M(jìn)行標(biāo)號(hào)。在原培養(yǎng)皿表面噴灑稀碘液，記錄有水解圈的單菌落，與此對(duì)應(yīng)找出合成淀粉酶的菌株1-2株。注意：未分離得到菌落的小組可與其他組合作，挑取其他組鑒定得到的菌落進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)報(bào)告中注明使用哪一組的菌落）。,7. 產(chǎn)淀粉酶菌株的增殖培養(yǎng),液體培養(yǎng)基分裝：10ml/瓶，每個(gè)菌株對(duì)應(yīng)

7、1瓶（每組1-2瓶，參考鑒定結(jié)果）液體培養(yǎng)基接種：用接種環(huán)從固體培養(yǎng)基表面上沾取少許菌苔，將接種環(huán)在液體培養(yǎng)基內(nèi)振搖幾次即可。做好標(biāo)記，放入搖床中振蕩培養(yǎng)24h。,8. 產(chǎn)淀粉酶菌株的純化——平板劃線法,灼燒接種環(huán)，冷卻后用接種環(huán)挑取少量菌苔左手持平皿，將皿蓋打開一條縫隙，右手將接種環(huán)伸入皿中，劃3-4條平行線灼燒接種環(huán)，60°旋轉(zhuǎn)平皿，劃線（注意：后一區(qū)要求與前一區(qū)首尾相連，但不得與其他區(qū)域搭在一起）灼燒接種環(huán)，將

8、劃線平板倒置，于30℃培養(yǎng)48h后觀察。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析,1. 取樣環(huán)境情況2. 記錄產(chǎn)淀粉酶菌株數(shù)量（比透明圈？？）及對(duì)菌落的初步鑒定結(jié)果3. 分析：從不同地點(diǎn)獲得的結(jié)果為什么會(huì)出現(xiàn)差異？可以初步得出什么樣的結(jié)論？（未分離出菌株的原因？）,細(xì)菌菌落特征,較濕潤(rùn)、光滑、透明、易挑取菌落正反面或邊緣與中央部位的顏色一致質(zhì)地均勻、小而突起（或大而平坦）有臭味或酸敗味,酵母菌菌落特征（與細(xì)菌相似

9、),圓形或卵圓形較濕潤(rùn)、較粘稠、光滑，易挑取菌落質(zhì)地均勻正反面、邊緣和中心顏色一致比細(xì)菌菌落大而厚，較不透明，顏色多呈乳白色多帶酒香味,霉菌菌落特點(diǎn),大而疏松，呈絨毛狀（曲霉）、絮狀（毛霉）、地毯狀（青霉）或蜘蛛網(wǎng)狀（根霉）有的無固定大小，延至整個(gè)培養(yǎng)基中產(chǎn)色素，使菌落顯色,放線菌菌落特征,干燥、不透明，小而緊密，呈放射狀菌落初期表面光滑或呈致密的絲絨狀，當(dāng)產(chǎn)生孢子之后，其菌落表面呈粉狀、顆粒狀菌落和培養(yǎng)基連接緊密，難

10、以挑取，或者整個(gè)菌落被挑起而不致破碎菌落顏色多樣，菌落正反面顏色常不一致帶有泥腥味,思考題,1. 為什么要用淀粉作為碳源？2. 為什么同一個(gè)土樣要稀釋不同梯度進(jìn)行涂平板？,實(shí)驗(yàn)報(bào)告,本次實(shí)驗(yàn)與上次實(shí)驗(yàn)合寫一份實(shí)驗(yàn)報(bào)告即可實(shí)驗(yàn)報(bào)告在本周六實(shí)驗(yàn)課時(shí)上交,注意,每次實(shí)驗(yàn)課前5分鐘由各實(shí)驗(yàn)室本次值日小組將實(shí)驗(yàn)材料由準(zhǔn)備室取出至各實(shí)驗(yàn)室中實(shí)驗(yàn)結(jié)束后請(qǐng)各組同學(xué)務(wù)必與實(shí)驗(yàn)老師處簽到后方可離開，否則記為缺勤最后一組同學(xué)使用完超凈臺(tái)后，需將臺(tái)