α-淀粉酶菌株搖瓶發(fā)酵初篩及酶活力測定

1、α-淀粉酶菌株搖瓶發(fā)酵初篩及酶活力測定,,目的要求,了解利用微生物搖瓶發(fā)酵初篩的目的。了解發(fā)酵用培養(yǎng)基的配制要求。掌握碘比色法（部頒標(biāo)準(zhǔn)）測定α-淀粉酶活力的原理和方法步驟。,發(fā)酵培養(yǎng)基（100mL裝于500mL三角瓶）,可溶性淀粉 8g；豆粕粉 4g；Na2HPO4 .12H2O 0.8g；（NH4）2SO4 0.4g；CaCl2 0.2gNH4Cl 0.15g；CaCO3 0.15

2、g水100mL121.3℃滅菌20分鐘,發(fā)酵培養(yǎng)基配制說明,三角瓶規(guī)格要統(tǒng)一。先將不溶解的可溶性淀粉、豆粕粉、 CaCO3分別稱于500mL三角瓶。將無機(jī)鹽稱量后先溶解于水中，調(diào)節(jié)pH為7.0~7.5，再用量筒量取100mL加于三角瓶中，輕搖混勻。121.3℃滅菌20分鐘滅完菌后取出，要馬上輕搖混勻（？）。,種子培養(yǎng)基（下周使用）,可溶性淀粉 3g；Na2HPO4 .12H2O 0.4g；（NH4）2SO4 0

3、.2g；CaCl2 0.2gNH4Cl 0.15g；4%豆粕粉浸出液 100mL煮沸使淀粉溶解后，取50mL分裝于250mL三角瓶（2瓶）包扎；取5mL分裝于18×180mm試管中（5支），加塞包扎。121.3℃滅菌20分鐘,其它器材,1mL無菌吸管 10支2mL無菌吸管 5支,相關(guān)碘液的配制,碘原液：稱取碘11g，碘化鉀22g，置于小燒杯中，加10ml蒸餾水使之溶解，然后轉(zhuǎn)入容量瓶中。再加少量的

4、蒸餾水洗滌燒杯數(shù)次，洗滌液均轉(zhuǎn)入容量瓶中，最后定容至500ml。搖均后放于棕色瓶中備用。比色稀碘液：取碘原液2ml，加碘化鉀20g，再用蒸餾水定容至500ml。搖均后放于棕色瓶中備用標(biāo)準(zhǔn)比色碘液：取碘原液15毫升，加碘化鉀8克，用蒸餾水定容至500毫升。儲藏于棕色瓶內(nèi)。,pH6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液：,pH6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液：稱取磷酸二氫鈉（Na2HPO4.12H2O）45.3g，檸檬酸（C6H8O7.H2O）7.

5、74g，先在燒杯中使之溶解，然后轉(zhuǎn)入容量瓶中定容至1000ml。,2%可溶淀粉溶液及標(biāo)準(zhǔn)糊精溶液配制,2%可溶淀粉溶液：稱取20g可溶淀粉，放入小燒杯中，加少量蒸餾水做成懸浮液。然后在攪拌下注入沸騰的700mL蒸餾水中，繼續(xù)煮沸一分鐘（透明），冷卻后用pH6磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液定容至1000ml。標(biāo)準(zhǔn)糊精溶液：取0.06克化學(xué)純糊精懸于少量水中調(diào)勻，然后傾入90毫升正在煮沸騰的蒸餾水中，冷卻后定容至100毫升，滴加數(shù)滴甲苯（現(xiàn)配現(xiàn)

6、用就不用加），冰箱保存。,標(biāo)準(zhǔn)終點色溶液,1、第一種標(biāo)準(zhǔn)終點色溶液取1mL標(biāo)準(zhǔn)糊精液和3mL標(biāo)準(zhǔn)稀碘液混合。2、第二種標(biāo)準(zhǔn)終點色溶液A液：精確稱取氯化鈷（CoCl.6H2O）40.2493g和重鉻酸鉀（K2CrO7）0.4878g，用蒸餾水定容至500ml。B液：精確稱取絡(luò)黑T40mg，用蒸餾水定容至100ml。同時取A液40ml、B液5ml、混合后置于冰箱中待用。混合液在15天內(nèi)使用有效。,方法及步驟,發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌冷卻后，

7、利用接種環(huán)接種一環(huán)上周培養(yǎng)好的斜面菌種。37 ℃搖瓶培養(yǎng)（往復(fù)式110轉(zhuǎn)/分鐘）2天。 2天后小漏斗脫脂棉花過濾發(fā)酵液。測定發(fā)酵液中α-淀粉酶酶活力單位（碘比色法）。根據(jù)結(jié)果選出1~2株進(jìn)行下周的復(fù)篩試驗。,所選菌株產(chǎn)α-淀粉酶搖瓶發(fā)酵復(fù)篩試驗的安排,上課前一天下午17：00~17：30將斜面菌種接種一環(huán)于5mL種子培養(yǎng)基中（裝于18×180mL），37 ℃搖瓶培養(yǎng)（旋轉(zhuǎn)式150轉(zhuǎn)/分鐘）14~16hr。上課當(dāng)天上午

8、8：00~8：30將上述搖瓶培養(yǎng)好的菌種，用1mL無菌吸管吸取1mL接種于50mL種子培養(yǎng)基中（裝于250mL三角瓶）， 37 ℃搖瓶培養(yǎng)（旋轉(zhuǎn)式150轉(zhuǎn)/分鐘）8~10hr。,所選菌株產(chǎn)α-淀粉酶搖瓶發(fā)酵復(fù)篩試驗的安排,當(dāng)天上課時間制備發(fā)酵培養(yǎng)基，3~5瓶/株菌（100mL/瓶），滅菌。將搖瓶培養(yǎng)好的菌種，用2mL無菌吸管吸取2mL接種于100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中（裝于500mL三角瓶）， 37 ℃搖瓶培養(yǎng)（旋往復(fù)式110轉(zhuǎn)/分鐘）2天

9、。2天后小漏斗脫脂棉花過濾發(fā)酵液。測定發(fā)酵液中α-淀粉酶酶活力單位（碘比色法）。根據(jù)結(jié)果可以判斷所選菌株產(chǎn)酶能力是否穩(wěn)定。,實驗 α-淀粉酶活力測定方法介紹,,酶活力測定的方法,碘比色法（有相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)） 在一定反應(yīng)條件下，1小時轉(zhuǎn)化1g淀粉變?yōu)楹拿噶慷x為1個酶活力單位3，5-二硝基水楊酸比色法（DNS法） 在一定反應(yīng)條件下，1分鐘反應(yīng)生成1mg麥芽糖的酶量定義為1個酶活力單位 注意：去除β-淀粉酶的干擾醫(yī)

10、學(xué)上的一些測定方法（專用試劑盒，通過生化儀器反應(yīng)測定，需要微量快速）,α-淀粉酶酶活力測定的原理,底物（反應(yīng)物）為淀粉產(chǎn)物為麥芽糖、糊精等,酶活力測定（碘比色法——目視）,酶活力定義：在60℃下1小時內(nèi)將1克淀粉轉(zhuǎn)化為糊精的酶量稱一個酶活力單位（5~10分鐘反應(yīng)完成）。淀粉及糊精檢測原理：碘檢測 淀粉（紫藍(lán)色，30分子以上）→紅色糊精（紅棕色，7-30分子）→無色糊精，7分子以下）→麥芽糖（不顯色）→葡萄糖（不顯色）計算公式

11、：,,酶活力測定步驟,,,,,對微生物酶發(fā)酵研究中的一些問題進(jìn)行討論,標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的問題（配制所需測定物質(zhì)的梯度濃度）酶的誘導(dǎo)問題（微生物長期適應(yīng)進(jìn)化的結(jié)果）酶發(fā)酵中氮源問題（蛋白質(zhì)合成的一些問題）酶的合成中能量問題（需要消耗大量的能量）搖瓶發(fā)酵中的容量問題（三角瓶，250、500ml）發(fā)酵中的溶解氧問題緩沖液的配制問題在α-淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基中CaCl2的使用問題在搖瓶發(fā)酵中非可溶性物質(zhì)的加入問題化學(xué)分析中基準(zhǔn)物的處理

12、（純度、結(jié)晶水的處理——不穩(wěn)定）,相關(guān)概念的介紹,復(fù)壯——狹義的復(fù)壯僅是一種消極的措施，指的是在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和測定典型性狀、生長性能等指標(biāo)，從已衰退的群體中篩選出少數(shù)尚在未退化的個體，以達(dá)到恢復(fù)原菌株固有性狀的相應(yīng)措施；而廣義的復(fù)壯則應(yīng)是一項積極的措施，即在菌種的典型特征或生產(chǎn)性狀尚未衰退前，就經(jīng)常有意識地采取純種分離和生產(chǎn)性狀的測定工作，以期從中選擇到自發(fā)的正變個體。,相關(guān)概念的介紹,菌種活化——使保藏的菌種（

13、休眠狀態(tài)）恢復(fù)到最佳生長狀態(tài)（包括一些菌種性能的恢復(fù)），生長狀態(tài)的均一化（相對）。一般包括：斜面活化（平板劃線形成單菌落）；液體搖瓶培養(yǎng)；種子培養(yǎng)（針對大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)）,相關(guān)概念的介紹,種子培養(yǎng)基： 營養(yǎng)成分相對豐富，一般無限制性因子，有利于菌體的增殖，生長好；發(fā)酵培養(yǎng)基： 營養(yǎng)成分有利于積累所需代謝產(chǎn)物，一般在培養(yǎng)基有一些限制性因子（包括培養(yǎng)條件）。注意： 種子培養(yǎng)基接種于發(fā)酵培養(yǎng)基時，注意微生物生長延滯期（有一定

14、營養(yǎng)成分重疊）。,實驗室搖瓶機(jī)（搖床）的作用,使培養(yǎng)基一直保持均勻狀態(tài)——菌體始終接觸到新的營養(yǎng)成分（相對來說）；快速稀釋代謝廢物（一般對細(xì)胞有毒害作用，對人類來說可能有用）增加培養(yǎng)基中溶解氧的濃度，提高菌種的有氧代謝強(qiáng)度，加快物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，有利于代謝產(chǎn)物的合成和積累。,搖瓶機(jī)的種類,旋轉(zhuǎn)式——轉(zhuǎn)速相應(yīng)較高（200轉(zhuǎn)以上），培養(yǎng)液貼壁旋轉(zhuǎn)；往復(fù)式——轉(zhuǎn)速不易太高，一般120轉(zhuǎn)/分左右，培養(yǎng)液來回振蕩，振蕩液面較高；往復(fù)式的溶氧效果較

15、好（相對旋轉(zhuǎn)式）；注意搖瓶機(jī)的振幅（偏心距）。,搖瓶發(fā)酵試驗時三角瓶裝量的要求,一般要求裝液量為三角瓶標(biāo)注容量的1/10~1/5如500ml三角瓶經(jīng)常加入50~100ml（常裝50ml或100ml）；如250ml三角瓶經(jīng)常加入25~50ml（常裝50ml）；注意：根據(jù)需要可以特制（如加擋板，增加溶解氧）。,菌種,斜面菌種活化（18~24hr）液體搖瓶活化（18~24hr）接種搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)（2%，48~72hr）,液體菌種活化