實驗八產(chǎn)淀粉酶菌種的鑒定

1、,實驗八 產(chǎn)淀粉酶菌種的鑒定,實 驗 目 的,1.了解微生物分類與鑒定中的基本程序和常規(guī)實驗技術(shù)與方法；2.熟悉16S rRNA基因PCR擴增進行細菌鑒定的基本原理并初步掌握PCR的操作技術(shù)；3.初步學(xué)會網(wǎng)上的有關(guān)網(wǎng)站的微生物資源信息和數(shù)據(jù)庫的使用并利用其進行細菌鑒定分析。,實 驗 原 理,細菌分類鑒定的方法：形態(tài)學(xué)特征的鑒定生理生化特征的鑒定分子特征的鑒定,形態(tài)學(xué)的鑒定,固體平板菌落，固體斜面，液體的培養(yǎng)特征；顯微鏡下的細

2、胞形狀，革蘭氏染色反應(yīng)，抗酸性染色，是否具有芽孢（芽孢在細胞內(nèi)的位置）、莢膜和鞭毛（鞭毛著生的位置）等。,分子鑒定,16SrDNA 是編碼原核生物核糖體RNA小亞基16SrRNA 的基因，與細菌整個基因組的變化相比，它具有高度的保守性，其變化的概率與細菌的變異和進化程度是一致的，所以有助于細菌的鑒定和分類。結(jié)合完善的數(shù)據(jù)庫，16SrDNA 序列分析可以快速準(zhǔn)確的對細菌進行種屬鑒定，確定細菌在進化中的位置。16SrDNA 序列包含10個

3、可變區(qū)和與之相間的11個恒定區(qū)。根據(jù)恒定區(qū)的保守性可以設(shè)計出細菌的通用引物，并且擴增出所有細菌的16SrDNA 片段?？勺儏^(qū)因細菌而異，能夠揭示生物物種特征核酸序列，是種屬鑒定的分子基礎(chǔ)。擴增細菌的16SrDNA 基因需要其染色體DNA 作為模板進行PCR， 可以提取細菌染色體DNA 作為模板，也可以直接挑取平板上經(jīng)過活化的菌落做PCR 以達到快速簡便的目的。,PCR的原理和步驟,原理 PCR是一種由引物介導(dǎo)的選擇性體外擴增D

4、NA的方法。步驟1. 變性（Denature）：目的雙鏈DNA片段在95℃下解鏈；2. 退火（Anneal）：兩種引物在適當(dāng)溫度（59℃ 左右）下與模板上的互補序列通過氫鍵配對；3. 延伸（Extension）：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最適溫度下，以目的DNA為模板進行合成。 由這三個基本步驟組成一輪循環(huán)，理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴增一倍，這些合成的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板，所以經(jīng)25-35輪循環(huán)就

5、可使DNA擴增達106 倍。,瓊脂糖凝膠電泳的原理,原理： 帶電顆粒在電場的作用下，向著與其電性相反的電極泳動的現(xiàn)象。 在本實驗中，DNA分子帶負電荷，向正極泳動。影響泳動率的因素： 電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)（即DNA分子本身的大小和構(gòu)型）。 在本實驗中，分子量越小，泳動越快。,實驗器材,1. 產(chǎn)淀粉酶的待檢菌的平板菌落（提前24小時劃線接種）；2. 革蘭氏染色全套試劑，載玻片

6、，酒精燈，接種環(huán)，光學(xué)顯微鏡；3. PCR反應(yīng)試劑：Taq酶，反應(yīng)緩沖液，dNTP，16S rRNA 基因上下游引物，模板（菌落）；4. 瓊脂糖，溴化乙錠，凝膠電泳儀，水平電泳槽，紫外檢測燈，TAE電泳緩沖液；5. 微量移液槍，槍頭，PCR管，PCR儀。,實驗步驟,（一）提前24h進行菌種活化 1.提前一天挑取單菌落，劃線淀粉培養(yǎng)基平板一塊（二）產(chǎn)淀粉酶待檢菌的培養(yǎng)特征與形態(tài)特征觀察與鑒定 1.培養(yǎng)特征的觀察：菌落形

7、狀與大小，邊緣，表面，隆起形狀，透明度，菌落與培養(yǎng)基顏色等； 2.細菌的革蘭氏染色：按照實驗二的操作方法進行（設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)的革蘭氏陽性和陰性菌為對照）。 3.細菌細胞的顯微觀察：細胞形狀是桿狀（長桿或短桿）還是球狀？有無芽孢？,（三）菌種保藏,從淀粉劃線平板上挑取PCR的單菌落，轉(zhuǎn)接固體斜面試管一支，至30℃培養(yǎng)24h.,用滅菌白槍頭在一平板單菌落邊緣挑取少許菌體，刮蹭于PCR管壁底部。 反應(yīng)體系：在一個P

8、CR管中用微量移液槍加入下列物質(zhì)的混合液25μl，置于冰上備用。 Taq buffer（10×）                MgCl2（25mM） dNTP（2.5 mM） 

9、0;                  Primer Forward（50 mM）      Primer Reverse（50 mM）

10、 rTaq（2U/μl）          ddH2O            震蕩，將菌體和反應(yīng)體系充分混勻 PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min后，95℃變性1 min，59℃退火1

11、min，72℃延伸2min，共25個循環(huán)，72℃延伸10min, 4 ℃ 保存。,,混合液25μl,（四）細菌的16S rRNA分子鑒定,（五）瓊脂糖凝膠電泳（下次實驗做） 1.制膠：配制1%瓊脂糖溶液20mL，用1×TAE電泳緩沖液做溶劑，加熱溶解，稍冷后，加入模具中，插入梳子，待膠凝固； 2.制樣：PCR反應(yīng)結(jié)束后，取出PCR管，用微量移液槍吸取5ul與1ul 6×樣品Buffer混合后全部點入浸于TAE

12、電泳緩沖液中的瓊脂糖凝膠的樣品孔中; 3.電泳：100V電泳20分鐘； 4.染色：將凝膠置于樣品染料溴化乙錠中染色；10min，然后將凝膠置于紫外燈下進行檢測，當(dāng)在凝膠上出現(xiàn)預(yù)期大小的DNA條帶（約1.5Kb），則認(rèn)為是PCR陽性，這時將與此電泳樣品對應(yīng)的PCR反應(yīng)管放置冰箱短期保存。,（六）PCR擴增片段測序 獲得的PCR陽性樣品由專人送往測序公司進行測序，大約一周后測序結(jié)果可以返回，然后在電腦的相關(guān)軟

13、件上進行讀序。（七）序列比對分析 使用NCBI 網(wǎng)站對待測菌的16SrDNA 序列與數(shù)據(jù)庫中各種菌的16SrDNA 序列進行比對。登陸http://www.ncbi.nlm.nih.gov 美國國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站，使用BLASTn 在GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB 基因庫中進行同源性搜索。從Genebank 中選擇近與待測菌目的基因序列同源性最高的已知分類的菌株的16SrRNA基因序列, 初步