SM22α及其缺失突變體的重組表達(dá)和功能研究.pdf

1、血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)表型轉(zhuǎn)化是動脈粥樣硬化、高血壓和血管成形術(shù)后再狹窄等血管重塑性疾病的共同病理生理特征。其中，VSMC表型轉(zhuǎn)化過程中，表型標(biāo)志基因的表達(dá)變化和細(xì)胞骨架的重構(gòu)是當(dāng)前國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)問題之一。平滑肌22α(SM22a)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種VSMC分化標(biāo)志物，其表達(dá)具有平滑肌組織特異性和細(xì)胞表型特異性，該蛋白與細(xì)胞骨架聚合有關(guān)。為了確定SM22α是否與細(xì)胞骨架蛋白肌動蛋白(actin)存在相互作用和其所依賴的結(jié)構(gòu)域，

2、以及二者之間的結(jié)合在VSMC骨架重構(gòu)和表型轉(zhuǎn)化過程中的病理生理學(xué)意義，本研究通過重組表達(dá)GST-SM22α融合蛋白及缺失ABS1和CLR結(jié)構(gòu)域的GST-SM22a(1-151)融合蛋白，來觀察SM22α和SM22α(1-151)在不同表型VSMC中與骨架聚合和細(xì)胞收縮之間的關(guān)系。 1 pGEX4T-SM22α和pGEX4T-SM22α(1-151)的構(gòu)建與鑒定 分別構(gòu)建GST-SM22α和GST-SM22α(1-151)

3、融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增和EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ雙酶切鑒定后，命名為pGEX4T-SM22α和pGEX4T-SM22α(1-151)。 2 GST-SM22α和GST-SM22α(1-151)融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)pGEX4T-SM22α和pGEX4T-SM22α(1-151)宿主菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后可表達(dá)預(yù)期分子量的GST-SM22α和GST-SM22α(1-151)融合蛋白，該融合蛋白以胞漿可溶性蛋白和包含體兩種形

4、式存在。誘導(dǎo)條件為培養(yǎng)物(OD<,600>=1.5)按1:50接種于含0.5 mM IPTG的LB培養(yǎng)液中，30℃振蕩培養(yǎng)6 h。 3 GST-SM22α和GST-SM22α(1-151)融合蛋白的分離純化 細(xì)菌裂解液上清直接經(jīng)GST親和層析進(jìn)行純化后，每100 ml培養(yǎng)物可得到約20 mg電泳純的可溶性GST-SM22α和GST-SM22α(1-151)融合蛋白。 4 離子強(qiáng)度對SM22α與actin結(jié)合活性的

5、影響 分別用含25 mM、50 mM、100 mM和150 mM KCl的結(jié)合緩沖液進(jìn)行GST pull down分析實(shí)驗(yàn)和F-actin體外聚合實(shí)驗(yàn)。GST pull down分析結(jié)果顯示，隨著KCl濃度的增高，結(jié)合有GST—SM22α的Sepharose 4B親和介質(zhì)上結(jié)合的actin量逐漸減少。F-actin體外聚合實(shí)驗(yàn)亦顯示，聚合緩沖液中KCl濃度越高，交聯(lián)沉淀的F-actin越少，證明SM22α與actin的結(jié)合活性受

6、KCl濃度的影響，二者的結(jié)合活性隨著KCl濃度的升高而減小。 5 SM22α與actin的相互作用依賴于ABSl和CLR結(jié)構(gòu)域 用結(jié)合有SM22α和SM22α(1-151)的GST Sepharose4B為親和介質(zhì)對VSMC F-actin組分蛋白進(jìn)行淘選，Westernblot分析表明，從結(jié)合有SM22α的親和介質(zhì)中可以檢測到actin的存在，而且在收縮型VSMC中親和得到的actin明顯多于合成型VSMC，但是結(jié)合有

7、SM22α(1-151)的親和介質(zhì)中沒有檢測到actin，說明SM22α是通過ABSl和CLR結(jié)構(gòu)域與F-actin相互作用的。將GST-SM22α和GST-SM22a(1-151)蛋白純品與F-actin共孵育，用SDS-PAGE可從孵育后離心得到的沉淀物中檢測到交聯(lián)的F-actin，而加入GST-SM22α(1-151)的孵育物中未得到沉淀的交聯(lián)F-actin，表明SM22α可通過其ABS1和CLR結(jié)構(gòu)域促進(jìn)F-actin發(fā)生體外交

8、聯(lián)。以上結(jié)果表明，SM22α通過ABS1和CLR結(jié)構(gòu)域與F-actin相互作用，從而參與VSMC表型轉(zhuǎn)化過程中actin的聚合和交聯(lián)。 結(jié)論： 1 成功構(gòu)建了GST-SM22α和GST-SM22α(1-151)融合蛋白大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，獲得電泳純的GST-SM22α和GST-SM22α(1-151)融合蛋白，每100 ml培養(yǎng)物可得到約20mg電泳純的可溶性融合蛋白。 2 證實(shí)KCl的濃度對SM22α與actin