重組人可溶性APRIL及其突變體的制備與功能分析.pdf

1、增殖誘導(dǎo)配體(APRIL)是腫瘤壞死因子(TNF)超家族的新成員之一，全長(zhǎng)為250個(gè)氨基酸，屬Ⅱ型跨膜蛋白，通過與其受體結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用。近年研究表明，APRIL密切參與了促進(jìn)多種惡性腫瘤細(xì)胞增殖、延長(zhǎng)惡性腫瘤細(xì)胞存活及加速腫瘤形成等多個(gè)過程。因此，該分子有望成為多種惡性腫瘤治療時(shí)進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)的新靶點(diǎn)，設(shè)法有效抑制APRIL的功能活性，將有可能為相關(guān)腫瘤的治療提供嶄新途徑。為此我們克隆和表達(dá)了重組人可溶性APRIL(solubleA

2、PRIL，sAPRIL)分子，在與TALL-1(TNFandapoptosisligand-relatedleukocyte-expressedligand1，又稱BLyS或BAFF)同源序列比對(duì)基礎(chǔ)上進(jìn)行突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)，借助一步反向PCR致突變法構(gòu)建人sAPRILcDNA的兩個(gè)突變體，進(jìn)而對(duì)sAPRIL及其突變體蛋白進(jìn)行表達(dá)、純化及生物學(xué)活性檢測(cè)。取得的主要結(jié)果如下： 1.經(jīng)RT-PCR成功地克隆了編碼人APRIL胞外區(qū)105-

3、250的cDNA(即sAPRILcDNA)，經(jīng)查對(duì)，與GenBank上登錄的編碼相應(yīng)APRIL胞外區(qū)cDNA的序列完全一致。 2.以獲得的pUC19/sAPRIL為模板，經(jīng)一步反向PCR法成功構(gòu)建了缺失編碼第187位谷氨酰胺的CAA和以編碼甘氨酸的GGA替換CAA的兩個(gè)突變體cDNA，分別命名為pUC19/msAPRIL1和pUC19/msAPRIL2。 3.將上述測(cè)序正確的野生型和突變型目的片段分別連接于原核表達(dá)質(zhì)粒p

4、QE-80L，成功地構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pQE-80L/sAPRIL、pQE-80L/msAPRIL1和pQE-80L/msAPRIL2。 4.將上述質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，均獲得了較高水平的表達(dá)，并確立sAPRIL及其突變體msAPRIL1、msAPRIL2在大腸桿菌中高效表達(dá)的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件均為終濃度1mmol/L的IPTG在37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h。SDS-PAGE分析可見，各重組蛋白的大小均約為19k

5、Da，主要是以包涵體的形式存在。Westernblotting分析顯示，各目的蛋白均在分子量約19kDa處出現(xiàn)單一條帶。 5.經(jīng)Ni2+-NTA純化系統(tǒng)及尿素透析，各重組蛋白得到了有效純化和復(fù)性。純化蛋白在SDS-PAGE上呈現(xiàn)單一條帶。 6.生物學(xué)活性分析顯示，所制備的重組人sAPRIL有明顯促進(jìn)人A549肺癌細(xì)胞及Jurkat淋巴瘤細(xì)胞增殖的作用，制備的msAPRIL1、msAPRIL2均能與這些腫瘤細(xì)胞上受體結(jié)合而