異常畢赤酵母1003胞外脂肪酶的分離純化及表征研究.pdf

1、本文報道了對異常畢赤酵母(Pichia anomala Kurtzman)1003發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化、所產(chǎn)胞外脂肪酶的分離純化及表征研究。通過培養(yǎng)基優(yōu)化獲得了適合該菌發(fā)酵和純化的培養(yǎng)基配方：通過硫酸銨沉淀、Sephacryl S-100凝膠過濾層析、DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析等方法對其發(fā)酵上清進(jìn)行純化，得到電泳純脂肪酶。其分子量約為54.9kDa，最適作用pH為5.5，最適作用溫度為45℃；該脂肪酶對鏈長

2、為C4到C18的脂肪酸酯、橄欖油、大豆油、花生油均能水解，但對中短碳鏈(<12C)的酯類有更好的水解效果。 1.異常畢赤酵母1003發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化及其脂肪酶的分離純化通過優(yōu)化獲得了利于脂肪酶生產(chǎn)和純化的發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件：豆餅粉6.0％，NH4NO30.6％，KH2PO40.3％，MgSO4.7H2O 0.25％，橄欖油乳化液0.1％，pH 5.8，發(fā)酵36h。 發(fā)酵上清通過pH4.0，40％硫酸銨飽和度的鹽

3、析得到粗分離，通過冷凍干燥進(jìn)行濃縮富集，再通過Sephacryl S-100凝膠過濾層析、DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析和超濾等步驟進(jìn)行純化、濃縮，得到了電泳純的脂肪酶，其純化倍數(shù)及活性回收率分別為206倍、6.09％。 2.異常畢赤酵母1003純化脂肪酶的表征研究通過SDS-PAGE估算P.anomala1003純化脂肪酶的分子量約為54.9kDa。 通過分光光度法測得其最適作用pH和

4、溫度分別為pH5.5、45℃；該酶在50℃以下、pH4.0-7.5的范圍內(nèi)有較好的穩(wěn)定性；Ca2+、Mg2+對該酶活性起促進(jìn)作用，大多數(shù)其它金屬離子對該酶活性起抑制作用，Cu2+、Fe3+及金屬螯合劑EDTA的抑制作用最為明顯；表面活性劑Triton X-100、Tween 80及Sodium Desoxycholate對該酶有明顯的促進(jìn)作用，而SDS則起抑制作用：通過對其天然底物及化學(xué)合成底物的水解特異性研究得出，該脂肪酶對鏈長為C4

5、到C18的脂肪酸酯、橄欖油、大豆油、花生油均能水解，但對中短碳鏈(<12C)的酯類有更好的水解效果。 用游離酶對該脂肪酶的轉(zhuǎn)酯化能力進(jìn)行初步探索，結(jié)果表明采用游離酶形式進(jìn)行催化得不到轉(zhuǎn)酯產(chǎn)物，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)確定其是否具有轉(zhuǎn)酯化能力。 3.異常畢赤酵母1003純化脂肪酶的質(zhì)譜測序?qū)υ摷兓久鸽娪竞筮M(jìn)行酶解、修飾、MALDI-TOF-MS分析，測得4個肽段的氨基酸序列，分別為：對該純化脂肪酶進(jìn)行質(zhì)譜分析，測定4個肽段

6、的氨基酸序列，分別為(從左到右為-N端-C端)：-V-Y-A-V-F-R-；-V-Y-Q(或K)-E-T-D-I(或L)-V-P-R-； -I(或L)-V-W-G-G-D-I(或L)-P-I(或L)-P-S-Y-S-R-； -I(或L)-Q(或K)-Y-G-E-V-T-I(或L)-I(或L)-T-Y-A-S-I(或L)-R.。由于目前國內(nèi)外均未見異常畢赤酵母脂肪酶基因序列的報道，以上4個肽段氨基酸序列的獲得，可為設(shè)計(jì)PCR引物，通過PC