解脂耶氏酵母胞外脂肪酶性質(zhì)研究.pdf

1、脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)是一類重要的工業(yè)酶制劑，可以催化酯化、轉(zhuǎn)酯化、水解、醇解等多種反應(yīng)，被廣泛用于生物燃料、食品加工、營(yíng)養(yǎng)品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)室所培育的解脂耶氏酵母（Yarrowialiploytica）含有多個(gè)脂肪酶基因，其所生產(chǎn)的混合脂肪酶已成功應(yīng)用于生物柴油、多元醇酯等產(chǎn)品的合成中。為細(xì)化對(duì)解脂耶氏酵母脂肪酶家族的了解，擴(kuò)展其脂肪酶應(yīng)用范圍，論文以解脂耶氏酵母胞外脂肪酶為研究重點(diǎn)，對(duì)Lip2、Lip

2、7、Lip8三個(gè)脂肪酶進(jìn)行異源表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)基礎(chǔ)理論研究，為后續(xù)解脂耶氏酵母脂肪酶家族應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本論文主要進(jìn)行如下工作:
　　(1)成功構(gòu)建pPICZaA-lip2、pPICZaA-lip7、pPICZaA-lip8三個(gè)重組質(zhì)粒，并在畢赤酵母GS115中成功實(shí)現(xiàn)Lip2、Lip7、Lip8的分泌表達(dá)。優(yōu)化了搖瓶階段發(fā)酵條件，在誘導(dǎo)溫度為25℃、誘導(dǎo)時(shí)間為72 h的發(fā)酵條件下，三個(gè)脂肪酶的水解酶活（對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯法）最佳，分

3、別是3.38 U/mL、0.18 U/mL、0.05 U/mL。
　　(2)本論文系統(tǒng)對(duì)比解脂耶氏酵母三個(gè)胞外脂肪酶催化能力，對(duì)畢赤酵母體系表達(dá)的脂肪酶進(jìn)行相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)的研究。Lip2、Lip7、Lip8的5L發(fā)酵罐發(fā)酵液的水解酶活分別為4000 U/mL、4.12 U/mL、1.71 U/mL，Lip2的水解活性優(yōu)于Lip7和Lip8。酶學(xué)性質(zhì)的基礎(chǔ)研究顯示:Lip2、Lip7、Lip8最適pH均為8.0;最適溫度分別為40℃、

4、40℃、50℃，論文從氨基酸組成上解釋了Lip8嗜熱的原因;不同金屬離子對(duì)三個(gè)脂肪酶活性的抑制或促進(jìn)程度不同，其中Ni2+抑制作用最為明顯;Lip2偏向水解長(zhǎng)鏈酯，而Lip7和Lip8偏向水解中鏈酯，并從空間結(jié)構(gòu)解釋脂肪酶底物特異性存在差異的原因。以上性質(zhì)上的差異，為后續(xù)三個(gè)脂肪酶的進(jìn)一步研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　(3)由于大腸桿菌具有發(fā)酵周期短、培育成本低的優(yōu)勢(shì)，本文對(duì)脂肪酶在大腸桿菌中的異源表達(dá)進(jìn)行初步探究。成功構(gòu)建pET22

5、b-lip7重組質(zhì)粒，并在大腸桿菌體系中實(shí)現(xiàn)解脂耶氏酵母脂肪酶Lip7的異源表達(dá)。優(yōu)化了搖瓶階段發(fā)酵條件:在誘導(dǎo)時(shí)間為12 h，表達(dá)宿主為Rosetta，誘導(dǎo)溫度為20℃的發(fā)酵條件下，Lip7的水解酶活最佳，為0.29 U/mL。
　　(4)解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2作為一種具有廣泛應(yīng)用價(jià)值的脂肪酶，其熱穩(wěn)定性較差，阻礙其應(yīng)用。本論文在實(shí)驗(yàn)室前期改造基礎(chǔ)上，嘗試進(jìn)一步提高Lip2的熱穩(wěn)定性。通過定點(diǎn)突變技術(shù)，成功構(gòu)建Lip2三個(gè)突

6、變子T117G/C244A、F237C/C244A、T117G/F237C/C244A，并在畢赤酵母GS115中成功實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)。最終突變酶T117G/F237C/C244A的熱穩(wěn)定性最佳，在50℃下的半衰期大于100 min，相較于本實(shí)驗(yàn)室前期改造的Lip2突變酶(14.4 min)，進(jìn)一步提高了Lip2的熱穩(wěn)定性。通過對(duì)脂肪酶空間結(jié)構(gòu)的分析，探討了突變酶熱穩(wěn)定性提高的機(jī)制，為深入了解解脂耶氏酵母脂肪酶家族結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供了理論基