解脂耶氏酵母脂肪酶基因7和8的克隆與表達(dá).pdf

1、據(jù)報(bào)道，解脂耶氏酵母（Yarrawia lipolytica）中有8個(gè)脂肪酶基因，本實(shí)驗(yàn)克隆并表達(dá)了其中的脂肪酶基因7和8，不僅為解脂耶氏酵母脂肪酶基因家族的研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，而且為開發(fā)與應(yīng)用解脂耶氏酵母脂肪酶提供了基因資源。本研究借助生物信息學(xué)，利用AJ549519和AJ549520基因序列設(shè)計(jì)引物，克隆出解脂耶氏酵母脂肪酶基因7和8。測(cè)序結(jié)果顯示：解脂耶氏酵母脂肪酶基因7和8的全長(zhǎng)分別為1101bp和1116bp，基因中不含內(nèi)含子

2、，兩個(gè)基因分別編碼366個(gè)和371個(gè)氨基酸殘基。在氨基酸水平上，其同源性和NCBI收錄的解脂耶氏酵母脂肪酶7和8比對(duì)達(dá)到100％和99％。將該基因克隆到pPIC9K表達(dá)載體上，利用電轉(zhuǎn)化首次實(shí)現(xiàn)了解脂耶氏酵母脂肪酶7和8在畢赤酵母GS115中的表達(dá)。發(fā)酵液上清經(jīng)硫酸銨沉淀后透析，透析產(chǎn)物用SDS-PAGE 法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)重組子在40KDa附近有特異性條帶；搖瓶發(fā)酵96h后畢赤酵母分泌的重組脂肪酶7和8的水解酶活分別達(dá)到49.49U/L和35

3、.98U/L。 酶學(xué)性質(zhì)的初步研究表明：解脂耶氏酵母脂肪酶7的最適溫度為55℃，最適pH8.0；在65℃中水浴2小時(shí)以后酶活力僅為處理前的29％；在pH 6.0～8.0范圍內(nèi)保持75％以上的酶活力；Mg2+2+對(duì)酶活力有顯著促進(jìn)作用；Cu 對(duì)酶活力有一定程度的抑制作用。解脂耶氏酵母脂肪酶8的最適溫度為45℃，最適pH 8.0；50℃以下該脂肪酶較穩(wěn)定，50℃以上酶活力開始明顯降低；pH穩(wěn)定性較好，在pH 6.0～8.0范圍內(nèi)保持

4、90％以上的酶活力；Zn2+2+對(duì)酶活力有顯著促進(jìn)作用；Cu、Mn2+對(duì)酶活力有一定程度的抑制作用。脂肪酶7和8均對(duì)中鏈酯（C4-C8）有較強(qiáng)的水解能力。 首次嘗試?yán)肂ioEdit軟件、PSIPRED和SwissModel等服務(wù)器對(duì)解脂耶氏酵母脂肪酶7和8的一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為解脂耶氏酵母脂肪酶7和8蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析提供了支持。分析結(jié)果顯示：預(yù)測(cè)的解脂耶氏酵母脂肪酶7和8在GHSLG區(qū)域具有高度的保守性；解