嗜冷桿菌低溫脂肪酶分離純化及表征.pdf

1、脂肪酶是一類能催化長鏈甘油三酯水解的水解酶，脂肪酶廣泛應(yīng)用于醫(yī)療和制藥工業(yè)、食品工業(yè)、精細化學(xué)合成以及環(huán)境治理等領(lǐng)域。脂肪酶催化手性有機化合物合成，以及發(fā)生酯化、酸解、醇解等反應(yīng)，是當(dāng)今酶工程領(lǐng)域的研究熱點。本實驗室從國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心獲得25株菌株，這些菌株來源于中國第四次北極科學(xué)考察的采集樣品。研究的目的是篩選產(chǎn)低溫脂肪酶的嗜冷細菌，分析表征嗜冷細菌脂肪酶的結(jié)構(gòu)和酶學(xué)性質(zhì)，便于脂肪酶的進一步開發(fā)利用。
　　本研究采用維多利亞

2、藍和溴甲酚紫脂肪酶篩選培養(yǎng)基，對25株細菌進行平皿初篩，根據(jù)變色圈直徑與菌落直徑的比值，查選產(chǎn)脂肪酶的菌株;對產(chǎn)脂肪酶菌株進行搖瓶發(fā)酵，檢測脂肪酶活性，進行復(fù)篩，確定一株產(chǎn)脂肪酶能力較高菌株;提取該菌株基因組，通過PCR技術(shù)獲得該菌株16S rDNA序列，測序后經(jīng)過序列同源性比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)與嗜冷桿菌屬相似度達到99％，確定該菌株為嗜冷桿菌屬，命名為Psychrobacter sp.ZY214。較佳產(chǎn)酶條件下的Psychrob

3、acter sp.ZY214發(fā)酵液，通過40％-60％飽和硫酸銨分級鹽析后獲得沉淀，利用50 mM Tris-HCl(pH8.0)溶解沉淀后，采用Phenyl Sepharose FF疏水層析分離，得到SDS-PAGE電泳純單一分離組分，活性檢測為脂肪酶;LC-MS-MS質(zhì)譜檢測分子量為38.1 kDa，命名為Lip ZC12。Lip ZC12的最適反應(yīng)溫度為40℃，最適反應(yīng)pH為8.0，Ca2+、Mg2+可以提高Lip ZC12的酶活

4、力，Lip ZC12具有較強的有機溶劑耐受性，50％ DMSO溶液中混合3小時，酶活性力保持95％左右。以對硝基苯基脂肪酸酯為底物，Lip ZC12的最適作用底物碳鏈長度為C12，Km值為13.1 mM，kcat值為1.20×103 s-1。利用脂肪酶三聯(lián)體活性中心(Ser-Asp-His)和氧負離子洞(oxyanion hole)區(qū)域的保守序列引物3種OXF、4種ACR，組合為12種引物，以Psychrobacter sp.ZY214

5、基因組DNA為模板，通過PCR方法進行脂肪酶基因片段擴增;通過保守序列PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果與已知脂肪酶序列對比分析，確認Lip ZC12保守序列與Psychrobacter sp.JCM18901脂肪酶前體具有相似性;利用Psychrobacter sp.JCM18901作為參照基因組設(shè)計3對引物，通過PCR擴增獲得脂肪酶全長基因，氨基酸序列與Psychrobacter sp.JCM18901脂肪酶前體相比，第32位I變?yōu)镸，第182位