蛇毒纖溶酶Alfimeprase在畢赤酵母中的表達、純化及活性鑒定.pdf

1、血栓性疾病是嚴重危害人類健康的疾病之一，而利用溶栓劑治療血栓病的溶栓療法被認為是最為有效的方法。據(jù)統(tǒng)計，全世界每年有血栓栓塞性病人約1700萬，所需的溶栓劑的潛在市場約20億美元。因此，尋找和研制新型、高效、安全的溶栓藥物并實現(xiàn)高效高活性表達，對于更有效地治療血栓性疾病具有十分重要的意義。 Fibrolase是來自美國銅頭蝮蛇毒的一種鋅金屬蛋白酶，具有纖溶活性而無出血活性。Alfimeprase(ALF)是Fibrolase的N

2、端突變體體(前3個氨基酸EQR曲Ser取代)，與Fibrolase具有同樣的溶栓功能，由美國Nuveo公司研制開發(fā)并申請了專利，其Ⅰ期關于治療慢性周圍動脈血栓(PAO)和Ⅱ期關于治療周圍靜脈導管栓塞病(CVAD)的臨床試驗結果顯示，ALF不僅是一種直接快速呈劑量相關的溶栓劑，而且很有希望成為第一個快速、高效、安全的蛇毒基因工程溶栓藥物，現(xiàn)已開始用于治療急性PAO和CVAD的Ⅲ期臨床試驗。 由于畢赤酵母(P. pastoris)表

3、達系統(tǒng)是目前較完善的高效異源蛋白表達系統(tǒng)，具有高分泌表達、高穩(wěn)定整合、易于高密度發(fā)酵和產(chǎn)物的下游純化等優(yōu)點，所以本研究采用該系統(tǒng)對ALF的高效高活性表達進行了研究。研究通過雙酶切從構建好的克隆載體p43-alf上獲取目的基因his6-alf,將其克隆至畢赤酵母分泌型表達載體pPIC9K和pPICZα A，經(jīng)高效電轉(zhuǎn)化、篩選鑒定、甲醇誘導表達獲得了重組ALF(rALF)高表達菌株GS115/pPIC9K-his6-alf,KM71/pPI

4、C9K-his6-alf和GS115/pPICZα A-his6-alf. SDS-PAGE和Western blotting分析表明rALF的分子量約為23.8 kDa，且能與小鼠抗His·tag的單克隆抗體特異結合，這說明rALF獲得了特異表達。通過對培養(yǎng)條件pH、每天甲醇流加終濃度、菌體生長密度和誘導時間的優(yōu)化，三種重組菌中rALF的表達量分別高達510 mg/L、465 mg/L和425 mg/L。同時可見pPIC9K-his6

5、-alf組菌中KM71重組菌比GS115重組菌表達的rALF更純，而GS115重組菌單位體積表達液中rALF的表達量更大。三種重組菌的優(yōu)化表達液經(jīng)His·bina柱純化后，rALF純度分別高達94.8％、96％禾1195％。纖維蛋白平板法纖溶活性鑒定結果表明rALF獲得了高活性分泌表達，且其纖溶活力呈現(xiàn)出劑量相關性和時間依賴性。另外，rALF的電泳檢測和混合纖溶活性測定分析結果顯示：對于rALF的高效高活性分泌表達而言，pPIC9K載體