φC31整合酶及HIV整合酶的結(jié)構(gòu)、功能初步解析.pdf

1、基因治療和轉(zhuǎn)基因研究中，利用定點(diǎn)整合酶有效地將目的基因位點(diǎn)特異性地整合到細(xì)胞基因組中，可以使目的基因獲得安全和長(zhǎng)期的表達(dá)。ΦC31整合酶作為一個(gè)來(lái)源于鏈霉菌噬菌體的位點(diǎn)特異性整合酶，近年來(lái)它被廣泛應(yīng)用于基因治療和轉(zhuǎn)基因研究中，但是和病毒載體相比，它存在一個(gè)效率較低的問(wèn)題。來(lái)源于HIV的慢病毒載體系統(tǒng)為目前最廣泛使用的整合性病毒基因載體，但是HIV整合酶介導(dǎo)的隨機(jī)整合構(gòu)成其基因治療應(yīng)用安全性隱患。開(kāi)發(fā)具備HIV整合酶整合效率和ΦC31整合

2、酶定點(diǎn)整合特點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因體系，對(duì)基因治療研究有重大意義。本研究的基本目的是解析ΦC31整合酶特異性DNA識(shí)別結(jié)合能力的基礎(chǔ)，并探討細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)對(duì)HIV整合酶介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因效率和基因表達(dá)的影響從而為研究整合酶的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系以及細(xì)胞蛋白對(duì)整合酶功能的影響，以及進(jìn)一步設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)上述體系提供所必需的前期理論基礎(chǔ)。
　　本文首先研究了ΦC31整合酶C端的DNA結(jié)合功能域。酵母雙雜交的方法篩選到11個(gè)和ΦC31整合酶有相互作用的細(xì)胞蛋白，其中DAX

3、X通過(guò)結(jié)合ΦC31整合酶的451RFGK454抑制其活性。在此基礎(chǔ)上，我們研究了這些氨基酸對(duì)ΦC31整合酶活性的影響及影響機(jī)制。首先，在大腸桿菌中通過(guò)藍(lán)白斑方法檢測(cè)整合酶活性，結(jié)果表明:去除了451RFGK454的突變體活性下降非常明顯，只有野生型的4.52％±3.56％，而突變體R451H也只保留了42.03％±7.08％的活性，說(shuō)明451RFGK454是ΦC31整合酶活性所必需的氨基酸。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法、最近鄰居法以及卷曲螺旋分析提示氨

4、基酸407-517的二級(jí)結(jié)構(gòu)符合Helix-Turn-Helix特征，可能為DNA結(jié)合基序。EMSA實(shí)驗(yàn)表明:451RFGK454去除或第451位精氨酸突變成組氨酸后，ΦC31整合酶的DNA結(jié)合能力以及結(jié)合的特異性都大大下降，說(shuō)明這四個(gè)氨基酸是影響整合酶對(duì)其底物特異性識(shí)別和結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸。但是預(yù)測(cè)的DNA結(jié)合基序407-517卻沒(méi)有DNA結(jié)合能力，去除這個(gè)基序的ΦC31整合酶也沒(méi)有結(jié)合能力。可能原因是表達(dá)的407-517基序它沒(méi)有很好

5、地折疊成HTH的結(jié)構(gòu)，圓二色譜方法證實(shí)了這一點(diǎn)，另一個(gè)原因可能是ΦC31整合酶本身結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性造成的，它并非簡(jiǎn)單地由某個(gè)單一的結(jié)構(gòu)域來(lái)完成某項(xiàng)功能，一個(gè)功能的完成也可能不僅依賴于某個(gè)特定結(jié)構(gòu)域，整個(gè)酶的各個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不是獨(dú)立的，而是互相協(xié)作的，407-517基序可能確實(shí)是負(fù)責(zé)特異性結(jié)合DNA的主要功能域，但是它單獨(dú)起作用無(wú)法完成識(shí)別和結(jié)合DNA這個(gè)過(guò)程，需要其它結(jié)構(gòu)域的協(xié)助。
　　接下來(lái)我們研究了細(xì)胞內(nèi)能夠和HIV-1整合酶

6、發(fā)生相互作用，抑制或促進(jìn)慢病毒基因組整合和基因表達(dá)的蛋白。
　　最初發(fā)現(xiàn)過(guò)轉(zhuǎn)SUMO1/Ubc9、SUMO2/Ubc9能改變HIV-1 IN在細(xì)胞內(nèi)的定位，由均勻彌散分布變?yōu)榧?xì)胞核內(nèi)的顆粒狀分布，HIV-1IN可能被定位到了內(nèi)源的PML核體上，HIV-1IN和PML的亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)顯示兩者具有強(qiáng)烈的共定位，因此推想:過(guò)轉(zhuǎn)的SUMO1/Ubc9或SUMO2/Ubc9可能起到一個(gè)橋梁的作用，它們能和HIV-1IN發(fā)生相互作用并把它帶到

7、內(nèi)源的PML核體上。基于這個(gè)推測(cè)，我們進(jìn)行了酵母配對(duì)實(shí)驗(yàn)、亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀分析，證明HIV-1IN能和SUMO1、SUMO2、Ubc9發(fā)生直接相互作用，和PML之間發(fā)生間接作用。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明HIV-1 IN能夠被SUMO1、SUMO2所共價(jià)修飾。最后我們考察了這些蛋白對(duì)慢病毒基因組的整合以及報(bào)告基因EGFP表達(dá)的影響。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)病毒感染后EGFP陽(yáng)性細(xì)胞率來(lái)較粗略地表征慢病毒基因組的整合情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn):單獨(dú)過(guò)轉(zhuǎn)Ub

8、c9時(shí)，EGFP陽(yáng)性率由載體對(duì)照組的37.29％±7.54％下降到了25.21％±2.63％(p＜0.05)，而Ubc9和SUMO1同時(shí)過(guò)轉(zhuǎn)時(shí)，下降更明顯，陽(yáng)性率為16.46±3.02％(p＜0.01)，有極其顯著性差異，Ubc9和SUMO2同時(shí)過(guò)轉(zhuǎn)時(shí)陽(yáng)性率變?yōu)?2.89％±4.49％(p＜0.05)。Ubc9可以極大地抑制慢病毒基因組的整合，并且SUMO1和SUMO2存在時(shí)抑制作用加強(qiáng)，存在加和作用。此外，我們還采用了Alu-LTRR

9、eal-Time Nested PCR的方法檢測(cè)慢病毒整合，結(jié)果和前一種方法吻合。最后我們檢測(cè)了報(bào)告基因EGFP的平均熒光強(qiáng)度變化，結(jié)果和對(duì)照組相比，平均熒光強(qiáng)度都下降到了80％左右，引起這種平均熒光強(qiáng)度變化的因素是Ubc9，SUMO1或SUMO2存在時(shí)沒(méi)有加和作用。盡管本實(shí)驗(yàn)證明PML蛋白對(duì)慢病毒感染并沒(méi)有抑制作用，但是PML-NB里的幾個(gè)主要組成型蛋白如sp100、DAXX等都對(duì)慢病毒感染具有不同程度的抑制作用，這幾個(gè)蛋白能夠被SU

10、MO化共價(jià)修飾或和SUMO有非共價(jià)相互作用，且都能夠和HIV-1IN發(fā)生直接的相互作用，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們提出了一個(gè)SUMO通路介導(dǎo)的PML-NBs抑制慢病毒感染的模型:HIV-1IN和Ubc9、SUMO直接結(jié)合，Ubc9是介導(dǎo)SUMO偶聯(lián)到它們底物上的關(guān)鍵酶，PML-NBs是一個(gè)高度SUMO化的結(jié)構(gòu)，結(jié)合了IN的Ubc9-SUMO復(fù)合體通過(guò)和定位在PML-NB上的E3連接酶的相互作用，將SUMO偶聯(lián)到它的底物如sp100、Daxx

11、上，因此通過(guò)SUMO通路，HIV-1IN被捕獲到PML-NB上，另一方面，HIV-1IN自身能夠被SUMO1、SUMO2所共價(jià)修飾，SUMO化后的IN也能夠定位到PML核體上。核體里的蛋白如sp100、DAXX等和IN發(fā)生直接相互作用，進(jìn)入下游信號(hào)通路，最終抑制慢病毒基因組的整合或基因表達(dá)，
　　綜上所述，本文初步解析了ΦC31整合酶C端的DNA結(jié)合功能域，找到了影響特異性DNA識(shí)別和結(jié)合的4個(gè)關(guān)鍵氨基酸，為利用ΦC31整合酶定點(diǎn)